ДЭНИЕЛ Л. ФАРКАС 1,21,2 и ДОРОТЕЯ БЕККЕР 33

11 Центр светомикроскопической визуализации и биотехнологии, Университет Карнеги-Меллон, Питтсбург, Пенсильвания 15213

22 Департамент биоинженерии, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания 15219

33 Департамент патологии, Университет Питтсбурга, Питтсбург, Пенсильвания 15213

∗∗ Запросы на перепечатки направлять доктору Доротее Беккер, Департамент патологии, BST E1050, Университет Питтсбурга, 211 Lothrop Street, Питтсбург, Пенсильвания 15213. Эл. почта: dbecker++@pitt.edu

Получена 3 сентября 2000 г.; в окончательной форме 6 сентября 2000 г.

Световые методы визуализации имеют широкое применение в медицине и биологии, и недавние достижения в оптических методах визуализации, таких как конфокальная и многофотонная сканирующая флуоресцентная микроскопия, биолюминесценция, оптическая когерентная томография и спектральная визуализация, открыли новые возможности для визуализации и регистрации во времени динамических изменений в генетических, эмбриональных и патологических механизмах, которые невозможно зафиксировать с помощью обычной световой микроскопии. В настоящей статье мы сосредоточимся на спектральной визуализации и, используя в качестве примера меланому человека и её предшествующие поражения, опишем способность спектральной визуализации выявлять заболевания на ранних стадиях, регистрировать профили экспрессии генов в тканевых образцах и визуализировать функции генов в опухолях, растущих у живых животных.

Ключевые слова: Спектральная визуализация; Меланома; Генный анализ

Когда свет падает на объект, он может быть переизлучён, отражён/рассеян, пропущен или поглощён. Спектроскопия измеряет эти явления во временной или частотной областях для определения важных химических или физических свойств исследуемого объекта. Добавление визуализации к спектроскопии берёт своё начало в спутниковом дистанционном зондировании, которое было разработано на основе предпосылки, что информация, присутствующая в оптических свойствах природных и искусственных объектов, может быть использована для обнаружения и мониторинга этих объектов на расстоянии. В отличие от спектроскопии, оптическая визуализация использует свет для исследования сцены с целью определения структуры и организации и, таким образом, представляет данные нашей зрительной системе для восприятия и понимания. Цветовое зрение человека — это форма визуализирующей спектроскопии, с помощью которой мы определяем интенсивность и соотношение длин волн, присутствующих в окружающей среде. Спектральная визуализация превосходит глаз тем, что может разбивать световое содержание изображения не только на красный, зелёный и синий (RGB), но и на произвольно большое число спектральных классов, а также может расширять диапазон, включая невидимые невооружённому глазу ультрафиолетовую (УФ) и инфракрасную (ИК) области спектра. В отличие от обычной микроскопии пропускания и флуоресценции, спектральная визуализация способна создавать качественные и количественные многопараметрические изображения высокого разрешения на уровне отдельных клеток.

Спектральная визуализация, определяемая как применение пространственно-разрешённого спектрального анализа к макроскопическим и микроскопическим образцам (1–3), позволяет получать спектр высокого разрешения — интенсивность как функцию длины волны — в каждом элементе изображения (пикселе). Результатом является куб данных, содержащий как спектральную, так и пространственную информацию. Спектральная информация может быть использована для объективной сегментации путём классификации каждого пикселя в изображении в соответствии с его спектральной сигнатурой. Вместо абсолютной классификации каждого пикселя интенсивности могут быть смоделированы как линейная комбинация спектров. Имея библиотеку базовых спектров, соответствующих компонентам образца, можно определить процентное содержание каждого базового спектра, вносящего вклад в пиксель. Используя эти процентные доли и общую интенсивность пикселя, можно количественно измерить и пространственно разрешить количество каждого материала из спектральной библиотеки в конкретном пикселе. На Рис. 1 показан принцип спектральной визуализации.

Существует несколько подходов к достижению спектральной визуализации: a) пространственно-разрешённая фурье-микроинтерферометрия (4), b) визуализация на основе жидко-кристаллического перестраиваемого фильтра (LCTF) (5) и c) визуализация на основе акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF) (6). Последние два метода являются последовательными по диапазонам, в том смысле, что куб спектрального изображения получается путём последовательного захвата изображений на каждой длине волны и, таким образом, позволяет корректировать вариации системы детектирования путём управления временем экспозиции (7). Кроме того, поскольку оба метода отклоняют поляризованный свет в одной ориентации, освещающий свет может быть ортогонально поляризован, что устраняет нежелательные зеркальные отражения. Ширина полосы пропускания может быть такой же узкой, как 1нм1нм, а спектральный диапазон с одним устройством может составлять от 400400 до 1000нм1000нм. Поскольку не требуется колесо фильтров, изображения идеально совмещены, и реконструкция изображения отличная. LCTF являются электронными, без движущихся частей, управляются и питаются от стандартного персонального компьютера. AOTF также основаны на кристаллах, но они значительно быстрее — микросекунды против миллисекунд — чем LCTF. На Рис. 2 представлена схематическая диаграмма микроскопической рабочей станции на основе AOTF.

Используя спектральную визуализацию в сочетании со специально разработанным программным обеспечением для обработки изображений, таким как Optimas, IP-Lab и InSpectre, в настоящее время можно спектрально различать и отображать до шести различных маркеров/параметров в данной ткани. Это достигается путём применения метода, известного как картирование подобия, к анализу данных, который на основе спектральной сигнатуры позволяет объективно и надёжно сегментировать интересующие элементы изображения от тех, которые представляют фон (8). Кроме того, можно применять усовершенствованные методы спектральной оценки, такие как линейная декомбинация или анализ главных компонент, для разделения очень близких параметров в спектральной области (9).

В отношении изучения тканей кожи главным преимуществом спектральной визуализации является её способность преодолевать проблему интерференции пигмента, которая, вызывая сильное рассеяние в видимом и ближнем ИК-диапазоне, может значительно снижать контраст и разрешение изображения. Применяя спектральную визуализацию в клинических и фундаментальных исследованиях меланомы человека и её предшествующих поражений, удалось получить важную новую информацию о пути прогрессирования меланоцитов человека, которую было бы трудно получить неоптическими методами.

Различные стадии, характерные для развития доброкачественных меланоцитарных поражений человека: нормальные меланоциты → меланоциты врождённого невуса → меланоциты обычного приобретённого невуса. Стадии, определяющие прогрессирование меланоцитов человека: меланоциты атипичного (диспластического) невуса → меланома in situ → первичная меланома в фазе радиального роста (RGP-меланома) → первичная меланома в фазе вертикального роста (VGP-меланома) → меланома в фазе метастатического роста (MGP-меланома). Меланома человека имеет несколько отличительных особенностей. Она возникает спорадически примерно в 90%90% случаев и является результатом семейной предрасположенности примерно в 10%10% случаев. Более чем у 60%60% всех пациентов спорадические и семейные формы меланомы развиваются поэтапно. Поскольку меланома, возникающая в атипичных невусах, которые являются предшественниками и маркерами риска заболевания, часто остаётся незамеченной, большинство пациентов обращаются с запущенной стадией. Однако если меланому обнаруживают на ранних стадиях, пациент часто излечивается путём широкого и глубокого иссечения опухоли.

Для пациентов с семейной меланомой и/или синдромом диспластического невуса (10) и, аналогично, для пациентов с клинической историей спорадической меланомы и многочисленными атипичными невусами, единственным способом в настоящее время предотвратить прогрессирование этих меланоцитарных поражений в меланому является постоянный мониторинг и их удаление при первых признаках изменения формы, размера и/или пигментации. Учитывая тёмную и разнообразную пигментацию атипичных невусов, невооружённому глазу часто трудно распознать меланому in situ и RGP-меланому, возникающую в смежных атипичных невусах. Таким образом, было бы очень полезно для этих пациентов, если бы можно было неинвазивно охарактеризовать атипичные невусы до их иссечения и гистологического анализа.

Чтобы определить, может ли спектральная визуализация обнаружить меланому in vivo при первом проявлении, мы визуализировали атипичные невусы у пациентов с клинической историей меланомы. Один из этих атипичных невусов, расположенный на шее пациента, и область, прилегающая к рубцу на спине пациента, где годом ранее был удалён атипичный невус, выявили спектрально сегрегированную область в невусе и рядом с рубцом, обе из которых явно отличались от окружающей ткани. После иссечения атипичного невуса и рубцовой ткани гистологическое исследование показало, что две спектрально сегрегированные области представляли собой меланому in situ (11). Аналогично, у другого пациента с клинической историей меланомы спектральная визуализация классифицировала и сегрегировала область в атипичном невусе, которая после иссечения и гистопатологического анализа была признана соответствующей RGP-меланоме (Рис. 3). Напротив, атипичные невусы, которые были подвергнуты спектральной визуализации, но не демонстрировали спектрально сегрегированных областей, отличных от спектрального профиля всего поражения(й), не дали доказательств при последующем гистологическом исследовании иссечённых невусов о развивающейся в них меланоме.

Предоставив доказательства того, что спектральная визуализация способна эффективно решать задачу неинвазивной характеристики атипичных меланоцитарных поражений при первом проявлении, следующей целью является создание спектральной карты для каждой патологической стадии пути прогрессирования меланоцитов человека. Учитывая технические достижения в спектральной визуализации и оптической когерентной томографии, которая также дала очень обнадёживающие результаты для визуализации морфологических деталей нормальной кожи и диагностики патологических изменений в кожных поражениях (12, 13), вскоре должно стать возможным рутинно внедрять эти оптические методы/устройства в клинике для обнаружения меланомы до того, как она перейдёт в запущенные стадии.

В отличие от обычной микроскопии пропускания и флуоресценции, спектральная визуализация способна напрямую и воспроизводимо сегментировать изучаемые клетки, локализовать и колокализовать белки и клеточные структуры, подсчитывать дискретные объекты на основе отдельных клеток и коррелировать экспрессию отдельных и множественных маркеров с микроархитектурой ткани.

На сегодняшний день большинство исследований, касающихся экспрессии генов и регуляции генов в VGP- и MGP-меланомах, проводились с использованием установленных клеточных линий, а в случае нормальных меланоцитов человека — с использованием первичных культур клеток. Однако для понимания молекулярных событий, управляющих началом и прогрессированием меланомы, необходимо идентифицировать и охарактеризовать гены, экспрессируемые в предшествующих поражениях меланомы и на ранних стадиях меланомы. В отличие от меланом поздних стадий, клетки, полученные из атипичных невусов, меланомы in situ и RGP-меланомы, не могут размножаться in vitro. Таким образом, единственный способ изучения профилей экспрессии генов на ранних стадиях развития меланомы — это анализ тканевых образцов. Что касается иммуногистохимического и гибридизационного анализа in situ тканевых срезов, приготовленных из пигментированных поражений, часто бывает трудно обнаружить гибридизационный сигнал в клетках, продуцирующих меланин. Кроме того, небольшой размер невоцитарных поражений и меланом ранних стадий часто является ограничивающим фактором в отношении количества тканевых срезов, которые могут быть получены из этих образцов, и, следовательно, количества параметров, которые могут быть оценены. На Рис. 4 представлены примеры того, как спектральная визуализация может обойти эти трудности.

Рис. 1. Принцип спектральной визуализации.

Рис. 2. Схематическое представление микроскопической рабочей станции на основе AOTF.

Стандартный высококачественный исследовательский микроскоп модифицирован для достижения спектральной и временной селекции как в возбуждении, так и в эмиссии с использованием AOTF. Для оптимальной работы требуются оптические модификации, такие как вставка призмы, корректирующей размытие изображения, и косое освещение.

Рис. 3. Макроскопический спектральный анализ RGP-меланомы, возникающей в атипичном невусе. (A) и (B) представляют собой 35-мм фотографии меланоцитарного поражения. (C) RGB-изображение, полученное из спектрального куба меланоцитарного поражения. Пиксели в RGB-изображении использовались для выбора спектров для классификации. (D) На спектральном изображении область, псевдоокрашенная синим, представляет спектрально сегрегированную область атипичного невуса. Области, псевдоокрашенные жёлтым и зелёным, отображают спектрально сегрегированные области, содержащие RGP-меланому. Области, псевдоокрашенные красным, соответствуют сильно пигментированным областям в атипичном невусе. Срезы тканей, окрашенные гематоксилином и эозином (H&E), показанные на панелях (E) и (F), изображают гистологию атипичного невуса (E) и RGP-меланомы (F).

Рис. 4. Микроскопический спектральный анализ образцов атипичного невуса. (A) Срез атипичного невуса, окрашенный гематоксилином и зондированный антителами к человеческому FGFR-1 и маркеру эндотелиальных клеток CD31. (B) Псевдоокрашенное спектральное изображение участка среза атипичного невуса, содержащего кровеносные сосуды. Сигнал FGFR-1 (зелёный), сигнал CD31 (красный), области в кровеносных сосудах, экспрессирующие как FGFR-1, так и CD31 (жёлтый), и контрастирование гематоксилином (синий). (C) Псевдоокрашенное спектральное изображение неконтрастированного среза атипичного невуса, окрашенного антителами к человеческому bFGF (красный) и FGFR-1 (зелёный). Клетки, экспрессирующие как bFGF, так и FGFR-1, псевдоокрашены жёлтым. (D) Срез атипичного невуса, окрашенный гематоксилином и зондированный антителом, специфичным к Stat3. (E) Спектральное изображение окрашенного среза невуса, показанного в D, выявляет присутствие белка Stat3 (псевдоокрашен красным) в цитоплазме клеток, но не в их ядрах (псевдоокрашены синим). (F) Неконтрастированный срез атипичного невуса, зондированный антителом к антигену CD31, был подвергнут качественному, а затем количественному спектральному анализу. Псевдоокрашенные красным кровеносные сосуды, пронизывающие срез невуса.

На Рис. 4A показана 35−мм35−мм фотография 5−μм5−μм среза атипичного невуса, проанализированного иммуногистохимически на экспрессию рецептора фактора роста фибробластов человека 1 (FGFR-1) и антигена эндотелиальных клеток CD31. Чтобы определить, экспрессируются ли FGFR-1 и CD31 в каждом кровеносном сосуде, пронизывающем срез атипичного невуса, тканевый срез, контрастированный гематоксилином и зондированный антителами к человеческому FGFR-1 и CD31, был подвергнут спектральной визуализации. Как показано на Рис. 4B, спектральное изображение, псевдоокрашенное для максимальной видимости, показало, что некоторые кровеносные сосуды экспрессируют как FGFR-1 (зелёный сигнал), так и антиген CD31 (красный сигнал), в то время как другие экспрессировали только FGFR-1 или только антиген CD31. Другой пример, документирующий преимущества качественной микроскопической спектральной визуализации перед обычной световой микроскопией, был получен при последовательном иммуногистохимическом окрашивании срезов атипичного невуса антителами к основному фактору роста фибробластов человека (bFGF) и FGFR-1. Спектральное изображение неконтрастированного среза атипичного невуса, зондированного двумя антителами, показало сильную экспрессию bFGF в эпидермисе, расположенном над дермальными невоцитами, которые представляют собой скопления меланоцитов, в то время как дермальные невоциты экспрессировали преимущественно FGFR-1. Эти результаты позволили предположить, что на патологической стадии, предшествующей меланоме in situ, bFGF не продуцируется меланоцитами, а эпидермальными кератиноцитами, что может означать, что bFGF, продуцируемый кератиноцитами, оказывает паракринное стимулирующее действие на рост невоцитов.

Помимо визуализации отдельных или множественных гибридизационных сигналов в отдельных клетках и/или клеточных компартментах, спектральная визуализация способна определять на основе отдельных клеток, находится ли белок в цитоплазме или ядре (14). На Рис. 4D изображено RGB-изображение среза атипичного невуса, контрастированного гематоксилином и зондированного антителом к фактору транскрипции Stat3. Спектральное изображение того же среза невуса, окрашенного антителом к Stat3 (Рис. 4E), представляет чёткое доказательство того, что белок Stat3 (псевдоокрашен красным) локализован в цитоплазме, но не в ядрах (псевдоокрашены синим) клеток.

Спектральное изображение, показанное на Рис. 4F, служит примером способности спектральной визуализации генерировать также количественные данные. Неконтрастированный срез, приготовленный из атипичного невуса, был зондирован антителом к антигену CD31. После качественного спектрального анализа CD31-окрашенных кровеносных сосудов (псевдоокрашены красным), пронизывающих срез невуса, изображение было подвергнуто сегмент-за-сегментом количественной спектральной визуализации, что дало точный учёт числа кровеносных сосудов, присутствующих в тканевом срезе.

Таким образом, примеры, показанные на Рис. 4, документируют спектр применений качественной и количественной микроскопической спектральной визуализации для изучения тканевых образцов и отдельных клеток. Поскольку спектральная визуализация устраняет необходимость в контрастировании клеток и тканевых срезов гематоксилином и/или эозином (H&E), в настоящее время можно спектрально визуализировать до шести различных параметров в клетках и тканях.

Животные модели человеческих новообразований традиционно полагались на изучение конечных точек, таких как рост или регрессия опухоли, гибель животных и исследования ex vivo резецированных тканей животных, для оценки распространения метастазов. Однако, учитывая быстрый прогресс в различных областях оптической биоимиджинга, становится всё более возможным визуализировать неинвазивно и в реальном времени динамические изменения в опухолях человека у живых животных.

Локализация и визуализация опухолей с использованием меченных фторохромами антител значительно улучшились благодаря разработке цианиновых конъюгатов, флуоресцирующих в ближнем ИК-диапазоне, и высокоскоростных цифровых камер с высокой чувствительностью в этом спектральном диапазоне (15). Сульфонидо-цианиновые фторохромы, излучающие от синего до дальнего красного и ближнего ИК, включая Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5 и Cy7, специально разработаны для высокого квантового выхода, хорошей химической стабильности и лёгкости конъюгации с носителями, такими как микросферы и антитела. Кроме того, цианиновые красители стабильны in vivo, имеют гораздо более длительный период полураспада, чем конъюгаты флуоресцеина или родамина, а сульфокислотные остатки на фторохромах делают их высокорастворимыми и предотвращают агрегацию конъюгированных антител. В отличие от меченных флуоресцеином или родамином антител, флуоресценция которых видна невооружённым глазом, но имеет высокий фон тканевой аутофлуоресценции и чувствительна к pH, конъюгированные с цианиновым фторохромом антитела нечувствительны к изменениям pH в диапазоне pH 4,0–9,0. Кроме того, они обладают высокой устойчивостью к фотообесцвечиванию, сохраняют яркость, а рассеяние и фон, обусловленный тканевой флуоресценцией, уменьшаются при работе на больших длинах волн (16). Поскольку цианиновые фторохромы имеют удобный диапазон максимумов возбуждения и испускания, многопараметрические таргетные цианин-конъюгированные антитела позволяют регистрировать миллисекундную и субмиллисекундную динамику в живых биологических системах, используя возбуждение на основе AOTF и охлаждаемые жидким азотом ПЗС-камеры со спектральной чувствительностью, пик которой приходится на ближний ИК (600–800 нм).

Чтобы оценить интенсивность флуоресцентных сигналов, испускаемых различными фторохромами после инъекции голым мышам, красители AMCA, Cy3, Cy5 и Cy7 были конъюгированы (17) с микросферами диаметром 6 мкм. Затем равные количества меченных различными цианиновыми красителями микросфер были инъецированы под кожу отдельных мышей. Используя соответствующие фильтры возбуждения и испускания для различных меченых микросфер и систему флуоресцентной визуализации, как описано ранее (17), области инъекций были визуализированы неинвазивно (Рис. 5). Благодаря значительно уменьшенному рассеянию света на больших длинах волн, захваченные изображения Cy5 (Рис. 5C) и Cy7 (Рис. 5D) превосходят изображения AMCA (Рис. 5A) и Cy3 (Рис. 5B).

Чтобы определить, могут ли быть получены изображения высокого разрешения на основе цианиновых красителей человеческих опухолей, выращенных у голых мышей, Cy5 был конъюгирован с моноклональным антителом, обнаруживающим антиген CD31 мыши, а Cy7 — с поликлональным антителом, связывающимся с антигеном S100, который экспрессируется на высоком уровне на клетках VGP- и MGP-меланомы человека.

Рис. 5. Изображения голых мышей, инъецированных фторохром-конъюгированными микросферами. Фторохромы AMCA, Cy3, Cy5 и Cy7 были конъюгированы с микросферами диаметром 6 мкм. Равные количества меченных различными цианиновыми красителями микросфер были инъецированы под кожу мышей, и флуоресцентные изображения областей инъекций были захвачены с помощью системы флуоресцентной визуализации и соответствующих фильтров возбуждения и испускания для различных красителей.

Используя аналогичные концентрации, меченые антитела были инъецированы по отдельности и в комбинации в центр VGP-меланом, выращенных в виде подкожных опухолей у голых мышей. Через двенадцать часов после инъекции антител мышей анестезировали, а их опухоли подвергали неинвазивной флуоресцентной визуализации in vivo. На Рис. 6 представлены два примера внутриопухолевых флуоресцентных изображений, полученных через кожу мышей. Первое изображение (Рис. 6A), без псевдоокраски, показывает кровеносные сосуды внутри VGP-меланомы, инъецированной конъюгированным с Cy5 антителом к CD31. Второе изображение (Рис. 6B), псевдоокрашенное, изображает кровеносные сосуды (псевдоокрашены красным), расположенные между скоплениями клеток меланомы (псевдоокрашены зелёным) в VGP-меланоме, которая была инокулирована как антителом к CD31, меченным Cy5, так и антителом к S100, меченным Cy7. Используя этот оптический метод визуализации, в настоящее время можно визуализировать детальные изображения внутри человеческих меланом, расположенных на глубине до 1 см под кожей живых мышей.

Развивая систему на шаг дальше, можно также захватывать серию полностью трёхмерных (3-D) томографических изображений таких опухолей. Это достигается путём размещения мышей на наклоняемой платформе, и изображения опухолей, инъецированных меченными фторохромами антителами, получаются с угловыми приращениями 5−10∘5−10∘ с использованием охлаждаемой ПЗС-камеры, оснащённой специальным макрообъективом и соответствующими эмиссионными фильтрами. Свет возбуждения подаётся через волоконно-оптический разветвитель, размещённый сверху и на равном расстоянии по бокам от опухолей для обеспечения однородного освещения. Полученные изображения затем обратно проецируются построчно с использованием специально разработанного программного обеспечения (3) для заполнения двумерного (2-D) изображения. Затем 2-D изображения наклоняются с использованием алгоритмов вращения и билинейной интерполяции, и результирующие изображения суммируются и контрастируются для просмотра (2, 7). Помимо определения 3-D структуры, оптические обратные проекции позволяют количественно оценить пространственно-временные изменения, такие как рост или остановка роста меченных фторохромами опухолей, выращенных у живых животных.

Рис. 6. Неинвазивная флуоресцентная визуализация человеческих меланом, выращенных в виде подкожных опухолей у голых мышей. Cy5, конъюгированный с антителом к CD31 мыши, и Cy7, конъюгированный с антителом, распознающим антиген S100 меланомы, инъецировали по отдельности или в комбинации в центр VGP-меланомы, выращенной в виде подкожной опухоли у голых мышей. Через двенадцать часов после инъекции антител мышей анестезировали, а опухоли подвергали флуоресцентной визуализации. Представлены два примера внутриопухолевых флуоресцентных изображений высокого разрешения, полученных неинвазивно через кожу мышей. (A) Изображение без псевдоокраски показывает кровеносные сосуды внутри VGP-меланомы, инъецированной конъюгированным с Cy5 антителом к CD31. (B) Псевдоокрашенное изображение изображает кровеносные сосуды (псевдоокрашены красным), расположенные между скоплениями клеток меланомы (псевдоокрашены зелёным) в VGP-меланоме, инокулированной как антителом к CD31, меченным Cy5, так и антителом к S100, меченным Cy7.

НАПРАВЛЕНИЯ БУДУЩИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящем обзоре мы на нескольких примерах проиллюстрировали широкий спектр возможностей спектральной визуализации для применений в медицине и биологии. Обнаружение злокачественных заболеваний на ранних стадиях, разрешение многопараметрических клеточных и молекулярных признаков одновременно в предраковых и злокачественных тканевых образцах и отдельных клетках с высоким пространственным, временным и спектральным разрешением, а также неинвазивные исследования экспрессии генов и их регуляции в реальном времени в опухолях человека, растущих у живых животных, — вот некоторые из областей, где спектральная визуализация будет играть важную роль. Однако ни спектральная визуализация, ни любая другая из недавно разработанных оптических технологий не ограничены в своём применении изучением онтогенеза млекопитающих. Фактически, достижения в объединении оптики, электроники и программного обеспечения, интегрированных в цифровые рабочие станции для визуализации, открыли новые возможности для функциональной визуализации в реальном времени в области развития млекопитающих, нейронаук, генной терапии и животных моделях биологии и заболеваний человека.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Грегори В. Фишера из Центра светомикроскопической визуализации и биотехнологии Университета Карнеги-Меллон за его вклад в часть исследований, представленных в этом обзоре. Работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения, Фонда исследований в области лечения рака и Американского фонда исследований рака для Д. Беккер, а также Национального научного фонда и Национального института рака для Д. Л. Фаркаса.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Farkas DL, Baxter G, DeBiasio RL, Gough A, Nederlof MA, Pane D, Patek DR, Ryan KW, Taylor DL. Multimode light microscopy and the dynamics of molecules. Ann Rev Physiol 1993;55:785-817
2. Farkas DL, Ballou BT, Fisher GW, Taylor DL. From in vitro to in vivo by dynamic multi-wavelength imaging. Proc SPIE 1995;2386:138-149
3. Farkas DL, Ballou BT, Fisher GW, Fishman D. Microscopic and mesoscopic spectral bioimaging. Proc SPIE 1996;2678:200-209
4. Cabib D, Buchwald RA, Garini Y, Soenksen DG. Spatially resolved Fourier transform spectro-scopy: a powerful tool for quantitative analytical microscopy. Proc. SPIE 1996;2687:278-291
5. Hoyt C. Liquid crystal tunable filters clear the way for imaging multiprobe fluorescence. Biophotonics Int 1996;3:44-51.
6. Wachman ES, Niu W, Farkas DL. AOTF microscope for imaging with increased speed and spectral versatility. Biophys J 1997;73:1215-1222
7. Farkas DL, Du C, Fisher GW, Lau C, Niu WN, Wachman ES, Levenson RM. Non-invasive image acquisition and advanced processing in optical bioimaging. Computerized Med Imaging Graphics 1998;22:89-102
8. Farkas DL. Spectral microscopy for quantitative cell and tissue imaging. In: Periasamy A. Methods in Cellular Imaging, Oxford University Press, Oxford and New York, in press
9. Levenson RM, Balestriere EM, Farkas DL. Spectral imaging: Prospects for pathology. In: Kohen E and Hirschberg JG. Applications of Optical Engineering to the Study of Cellular Pathology. Research Signpost, Trivantum, India, vol. 2, 1999, pp. 133-149.
10. Greene MH, Clark WH Jr, Tucker MA, Elder DE, Kraemer KH, Guerry D 4th, Witmer WK, Thompson J, Matozzo I, Fraser MC. Acquired precursors of cutaneous malignant melanoma. The familial Dysplastic Nevus Syndrome. Med Intell 1985;312:91-96
11. Yang P, Farkas DL, Kirkwood JM, Abernethy JL, Edington HD, Becker D. Macroscopic Spectral Imaging and gene expression analysis of the early stages of melanoma. Mol Med 1999;5:785-794
12. Boppart SA, Bouma BE, Pitris C, Southern JF, Brezinski ME, Fujimoto JG. In vivo cellular culture coherence tomography imaging. Nature Med 1998;4:861-865
13. Pan Y-T, Farkas DL. Noninvasive imaging of living human skin with dual- wavelength optical coherence tomography in two and three dimensions. J Biomed Opt 1998;3:446-455
14. Kirkwood JM, Farkas DL, Chakraborty A, Dyer KF, Tweardy DJ, Abernethy JL, Edington HD, Donnelly SS, Becker D. Systemic interferon-alpha (IFN-α) treatment leads to Stat3 inactivation in melanoma precursor lesions. Mol Med 1999;5:11-20
15. Mujumdar RB, Ernst LA, Mujumdar SR, Lewis CJ, Waggoner AS. Cyanine labeling reagents: Sulfonidocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chem 1993;4:105-108
16. Ballou B, Fisher GW, Farkas DL. Tumor detection and visualization using cyanine fluorochrome-labeled antibodies. Biotechnol Prog 1997;13:649-658
17. Ballou B, Fisher GW, Waggoner AS, Farkas DL, Reiland JM, Jaffe R, Mujumdar RB, Mujumdar SR, Hakala TR. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1995;41:257-263