Институт генетики растений и исследований культурных растений имени Лейбница (IPK), Gatersleben, Corrensstr. 3, 06466 Seeland, OT Gatersleben, Germany

* Автор для корреспонденции: tschiers@ipk-gatersleben.de

Предпосылки. Автоматизированное фенотипирование растений стало мощным инструментом изучения роста, развития и реакции на биотические и абиотические стрессоры. Соответствующие комплексы преимущественно используют неинвазивные методы визуализации, позволяющие непрерывно количественно отслеживать динамику роста и физиологии в ходе развития. Однако интегрированные автоматические высокопроизводительные измерения сложных физиологических параметров, например эффективности фотосистемы II, определяемой кинетическим анализом флуоресценции хлорофилла, особенно у крупных растений всё ещё представляют трудность.

Результаты. Представлены технические установки и экспериментальные процедуры, обеспечивающие интегрированную высокопроизводительную визуализацию всех распространённых параметров ФСII у малых и крупных растений. Системы кинетической визуализации флуоресценции хлорофилла FluorCam (PSI) были встроены в автоматические фенотипические комплексы Scanalyzer (LemnaTec). Помимо максимальной эффективности ФСII, основное внимание уделено протоколам определения рабочей эффективности ФСII (ΦPSII), пригодным для высокопроизводительного анализа. Показано, что ΦPSII воспроизводимо измеряется у растений разного размера, несмотря на изменение расстояния между растением и источником света и возникающие небольшие различия падающей освещённости. Значения ΦPSII автоматической системы хорошо коррелировали с данными традиционного точечного флуориметра. Созданные протоколы позволяют анализировать до 1080 малых и 184 крупных растений в час. Применимость показана на скрининге больших популяций Arabidopsis и кукурузы для оценки естественной вариабельности эффективности ФСII.

Выводы. Интеграция систем кинетического анализа флуоресценции хлорофилла существенно расширяет набор признаков, доступных автоматизированным платформам: одновременно оцениваются архитектура, биомасса и физиология, включая рабочую эффективность ФСII. Протоколы применимы к широкому спектру модельных и культурных растений высотой до 1,80 м и с различной архитектурой. Более глубокое понимание связи архитектуры, формирования биомассы и фотосинтетической эффективности перспективно для улучшения культур и урожайности.

Ключевые слова: визуализация флуоресценции хлорофилла (CFI); высокопроизводительный скрининг; фенотипирование растений; фотосинтез; рабочая эффективность ФСII.

Фенотипирование растений — развивающаяся область, в которой признаки, связанные с формированием биомассы и урожая, устойчивостью к стрессам и эффективностью использования ресурсов, регистрируют автоматически, неинвазивно и с высокой производительностью. Сопоставление таких признаков с геномной информацией позволяет выявлять генетические компоненты их проявления. Успешное улучшение культур требует интегрированной оценки генома и фенома; последний должен включать широкий набор точно измеренных признаков больших популяций, необходимый для картирования сцепления и полногеномного поиска количественных локусов (QTL).

В последние годы появились многочисленные технологии высокопроизводительного фенотипирования, однако многие из них сосредоточены на архитектуре растений и биомассе [1–4]. Биомассовая составляющая урожая в значительной степени зависит от эффективности использования излучения, определяемой морфологией — архитектурой полога и перехватом света — и фотосинтетической эффективностью [5]. Следовательно, нужны интегрированные решения для одновременного анализа морфологии и физиологии и количественного высокопроизводительного измерения физиологического состояния [6].

Флуоресценция фотосистемы II чувствительна к изменениям фотохимии [7]. Визуализация флуоресценции хлорофилла (CFI) — неразрушающий метод, пригодный для повторного применения в течение роста. Она обеспечивает двумерный анализ кинетики флуоресценции во времени на уровне листа или целого растения [8]. Продолжительность измерения составляет от нескольких минут до секунд, поэтому метод подходит для автоматизированного высокопроизводительного анализа [5,6,9].

Современные флуориметры обычно используют модулированный источник света. Импульсно-амплитудная модуляция (PAM) позволяет исследовать активность и регуляцию ФСII и состояние фотосинтетического аппарата. Растение освещают модулированным светом известной частоты, а детектор измеряет сигнал на той же частоте [10], поэтому окружающий свет не влияет на результат и затемнение растений не требуется. Яркий насыщающий импульс временно максимально восстанавливает пластохинон A (QA) и закрывает все реакционные центры ФСII [11,12]. Это позволяет разделить фотохимическое и нефотохимическое тушение [6] и вычислить ΦPSII.

ΦPSII имеет особое значение как приближение эффективности использования света [13]. Он характеризует относительный квантовый выход ФСII — долю поглощённого света, реально использованную в фотохимии, — и применяется для расчёта линейного транспорта электронов [14]. Этот процесс коррелирует с квантовым выходом ассимиляции CO₂ и общей фотосинтетической способностью [15]. ΦPSII позволяет быстро сравнивать множество растений практически одновременно и в почти одинаковых условиях [16,17].

Ранее CFI-платформы среднего и высокого потока создавались главным образом для малых розеточных растений: FluorImager [18], GROWSCREEN FLUORO [19], Phenovator [20], PlantScreen [21]. Позднее появились комплексы для растений среднего размера, включая злаки до 1,40 м. Высокопроизводительные CFI-системы для культур выше 1,50 м не описывались, хотя они важны для селекции. CFI широко применяется для ранней диагностики биотических и абиотических стрессов [22], включая засуху [19,23,24], холод [19,25–27], дефицит питания [28], биотический стресс [29–32] и световую акклимацию [33]. Естественная вариабельность фотосинтеза также представляет резерв повышения урожайности [6,13,34,35].

В настоящей работе CFI интегрирована в существующие комплексы для одновременной оценки архитектуры, биомассы и фотосинтетической эффективности у растений высотой до 1,80 м. Быстрые протоколы проверены сравнением со стандартными ручными измерениями. Производительность продемонстрирована на больших наборах образцов Arabidopsisи кукурузы.

В IPK Gatersleben используются три Scanalyzer (LemnaTec AG) для растений разного размера. Система малых растений расположена в фитокамере и позволяет неразрушающе оценивать до 4600 растений Arabidopsis. Система крупных растений в тепличной камере рассчитана на 1684 растения. Стандартизованные протоколы выращивания описаны ранее [4]. Обе установки дополнены FluorCam (Photon Systems Instruments, Брно), работающими с слабым модулированным измерительным светом, насыщающими импульсами и актиничным светом по принципу PAM.

FluorCam включает туннель световой адаптации и модуль визуализации. Последний состоит из CCD-камеры и светодиодной панели, формирующей измерительный, актиничный свет и насыщающие импульсы. Холодные белые диоды имеют широкий максимум 480–720 нм и резкий максимум 436 нм; оранжево-красные — 620 нм с полушириной около 5 нм; дальнекрасные — 735 нм с полушириной около 12 нм. Белые и красные LED снабжены коллиматорами с углами около 13° и 16°, что обеспечивает слабое почти линейное вертикальное уменьшение интенсивности и высокую однородность PAR. CCD регистрирует 720×560 эффективных пикселей.

Рисунок 1. FluorCam, интегрированные в Scanalyzer для малых и крупных растений: (a) панели в верхней ориентации и туннели адаптации; (b) расположение LED на панели крупной системы; (c) расположение LED на панели малой системы.

Модули размещены в закрытых камерах, исключающих изменение окружающего света. Высота панели крупной системы регулируется по средней высоте растений. Обе системы выполняют съёмку сверху; малая дополнительно поддерживает боковую съёмку. Она пригодна для розеточных растений сверху и проростков высотой до 10 см сбоку; поле сверху 110×140 мм. Крупная система работает с растениями до 1,80 м и имеет поле 800×800 мм. Интенсивность насыщающего импульса в центре носителя составляет 4100 и 3800 мкмоль·м⁻²·с⁻¹ для малой и крупной систем.

Рисунок 2. Распределение интенсивности света. (a, b) Зависимость PAR от расстояния до FluorCam или панели туннеля при разных настройках для малой и крупной систем. (c–e) Пространственное распределение PAR по верхней площади носителя: свет туннеля адаптации, актиничный свет FluorCam и насыщающий импульс. Все значения приведены в мкмоль·м⁻²·с⁻¹.

Однородность насыщающих импульсов составляла 3540–3870 мкмоль·м⁻²·с⁻¹ в крупной и 3870–4100 в малой системе. Туннели адаптации обеспечивали одинаковую предварительную экспозицию, необходимую для точного ΦPSII. Около 95% PAR давали белые LED, 5% — оранжево-красные, 0,4% — дальнекрасные. Одновременно адаптировались до 132 малых растений (12 на носителе) или 40 крупных (4 на носителе). Максимум составлял соответственно 916 и 1028 мкмоль·м⁻²·с⁻¹, а диапазоны по площади носителя — 868–928 и 986–1038.

После съёмки изображения автоматически сегментировали в FluorCam и извлекали признаки для каждого пикселя либо средние значения всего растения. Для нескольких растений в кадре применяли заранее заданные маски областей интереса. Исходные/обработанные изображения и таблицы CSV сохраняли в облачной базе в сжатом архиве. Уникальные идентификаторы позволяли объединять данные FluorCam с признаками других датчиков.

PAR почти линейно уменьшался с расстоянием. В туннелях снижение составляло около 5 и 1 мкмоль·м⁻²·с⁻¹ на сантиметр для малой и крупной систем. В малой камере — 10, в крупной — 0,9 на сантиметр на расстоянии 50–80 см и 2,3 выше 80 см. При рабочем PAR=350, соответствующем теплице, снижение было лишь около 1 на сантиметр. Настройки корректировали для рабочих расстояний около 27 и 55 см. Крупная панель 120×120 см содержит 224 белых/дальнекрасных и 672 оранжево-красных LED; малая 47×34 см — 20 и 60 соответственно.

Чтобы имитировать одинаковую фотосинтетическую активность у растений разной высоты, Arabidopsis, табак и кукурузу измеряли на разных расстояниях. В малой системе уменьшение расстояния на 7 см повышало освещённость примерно на 10%, но снижало ΦPSII у Arabidopsis лишь на 6,5%. В крупной системе увеличение расстояния на 60 см снижало свет на 18%; ΦPSII табака возрастал примерно на 8%, тогда как у кукурузы почти не менялся. Проверка восьми линий кукурузы подтвердила слабый эффект расстояния.

Рисунок 3. Изменение падающей освещённости при изменении расстояния и влияние на ΦPSII: (a) *Arabidopsis* Col-0, 28 суток после посева (DAS), малая система; (b) *Nicotiana tabacum* SNN, 35 DAS; (c) *Zea mays*, 36 DAS, крупная система. Показаны псевдоцветные изображения, средние±SD для 4–5 повторов; буквы обозначают различия p<0,05 по ANOVA и тесту Бонферрони.

Для четырёх линий кукурузы записывали световые кривые ETR при ступенчатом повышении интенсивности до 600 мкмоль·м⁻²·с⁻¹. Все значения находились в линейной части световой кривой, поэтому ΦPSII и рассчитанный ETR лишь незначительно менялись. Системы обеспечивали сопоставимое определение ΦPSII при неодинаковой высоте и небольшой вариации света.

Рисунок 4. (a) Влияние расстояния и падающей освещённости на ΦPSII восьми линий кукурузы, 27 DAS. (b) Световые кривые кажущейся скорости транспорта электронов ETR; актиничный свет подавали последовательными 60-секундными ступенями уменьшающейся интенсивности. Средние±SD, n=4–5.

Протокол определяет время анализа каждого растения. Fv/Fm темноадаптированных растений измеряется быстро: малая система обрабатывает до 154 носителей или 1848 растений в час, крупная — 70 носителей или 280 растений. Определение ΦPSII требует полного светового равновесия. Для Arabidopsis оптимизированы 5–8 мин в туннеле и 10 с в камере с той же интенсивностью перед насыщающим импульсом. Удвоение обоих интервалов давало почти те же результаты (R²=0,9609). Производительность достигала 90 носителей/ч, то есть 1080 растений/ч при 12-луночном носителе.

Рисунок 5. Сравнение протоколов ΦPSII, различающихся временем в камере и туннеле: (a) малая система; (b) крупная; (c) влияние 5/10 мин адаптации и 10/60 с измерения на восемь линий кукурузы, 48 DAS, PAR=350. Средние±SD 4–5 повторов; различия p<0,05.

Для вертикально ориентированных проростков удобна боковая съёмка. У пшеницы длительность верхней адаптации не влияла на ΦPSII, но увеличение бокового освещения в камере значительно меняло показатель. Из-за крутых листьев верхнего света недостаточно для полного равновесия в той ориентации, в которой растение освещается при боковой съёмке. Поэтому требуется более длительная боковая экспозиция; текущая однопозиционная камера ограничивает поток примерно 50 носителями/ч.

Рисунок 6. Боковая съёмка в малой системе: (a) установка; (b) влияние времени измерения и адаптации на ΦPSII проростков пшеницы «Kanzler», 9 DAS; (c) изображения ΦPSII при 10, 20 и 60 с, PAR=450. Средние±SD четырёх повторов.

Для крупных растений 5–8 мин адаптации и 10 с освещения также давали воспроизводимые результаты. 10 мин и 60 с повышали ΦPSII лишь на 2–7% для семи из восьми линий. У одной низкорослой линии эффект был сильнее из-за затенения соседними высокими растениями. Максимум крупной системы — 46 носителей/ч или 184 растения/ч при четырёх горшках.

Протокол можно выбирать между максимальным потоком и максимальной точностью. Более сложные световые кривые и полные протоколы тушения NPQ/qL занимают несколько минут и выполняются со средней или низкой производительностью 8–10 носителей/ч, например для предварительно отобранных генотипов. Для NPQ и других параметров необходима дальнейшая проверка.

Средние значения ΦPSII по целому побегу сравнили с точечным Mini-PAM. Для Arabidopsis и пшеницы использовали малую систему сверху и сбоку, для кукурузы — крупную сверху. Ручные измерения проводили на развитых листьях Arabidopsis, центральных участках молодых листьев пшеницы и развитых листьях кукурузы непосредственно после CFI (Arabidopsis, пшеница) или перед ней (кукуруза). Во всех случаях обнаружены значимые положительные корреляции R²>0,92.

Рисунок 7. Связь ΦPSII FluorCam и неимиджингового Mini-PAM: (a) малая система сверху, *Arabidopsis*, 19 DAS, R²=0,9758; (b) малая система сбоку, пшеница, 9 DAS, R²=0,9706; (c) крупная система сверху, кукуруза, 37 DAS, R²=0,9294. Интенсивность актиничного света варьировали в пределах 12–590 и 138–600 мкмоль·м⁻²·с⁻¹.

С применением протокола 5 мин/10 с исследовали 384 образца Arabidopsis и 326 образцов кукурузы. Arabidopsis измеряли на 19 DAS с 5–12 повторностями, случайно распределёнными по фитокамере. Два образца имели особенно низкие ΦPSII 0,45 и 0,48; линия 105 показывала пространственную неоднородность между листьями. У остальных ΦPSII постепенно изменялся от 0,57 до 0,66.

Рисунок 8. Скрининг 384 образцов *Arabidopsis*: (a) примеры карт ΦPSII интересных образцов; (b) вариабельность средних ΦPSII в 19 DAS, 5–12 растений на образец, PAR=240.

Кукурузу анализировали в крупной системе с максимум восемью повторностями на образец. Вариабельность была значительно выше: средние по растению значения 0,255–0,505. Различия выбранных подмножеств воспроизводились в независимых выращиваниях и измерениях.

Рисунок 9. Скрининг 326 образцов кукурузы: (a) примеры карт ΦPSII; (b) вариабельность в 26 DAS, 1–8 растений на образец, PAR=600.

Встроенные PAM-системы расширили существующие платформы, ранее измерявшие преимущественно архитектуру и биомассу. Теперь структурные и физиологические признаки растений высотой до 1,80 м регистрируются в короткие интервалы. Протоколы Fv/Fm и ΦPSII проверены и применены к популяциям Arabidopsis и кукурузы.

Ранние системы переносили датчик над неподвижными лотками малых растений [13,18–20]. Здесь неподвижный измерительный модуль обслуживает растения, доставляемые конвейером; число анализируемых растений ограничивается главным образом площадью выращивания. Регулируемая высота панели позволяет работать с разными растениями. Поздние plant-to-sensor платформы объединяют CFI с RGB и иногда гиперспектральной съёмкой, но в основном ограничены растениями до 1,40 м.

Производительность малой системы для ΦPSII около 1080 растений/ч сопоставима с Phenovator — примерно 1440 растений/ч [20]. Для Fv/Fm получено 1848 растений/ч, что превышает ряд альтернатив. Крупная система впервые обеспечивает точное измерение растений до 1,80 м с максимумом 184 растений/ч для ΦPSII и 280 для Fv/Fm. Это достаточно для оценки суточной динамики и сложных протоколов.

Полная тёмная или световая адаптация — обязательное условие. Однородность достигается крупными LED-панелями туннеля и станции. Несмотря на большие площади и диапазоны высоты, сфокусированные LED высокой плотности создавали лишь небольшие различия света, не искажавшие ΦPSII кукурузы. Влияние горизонтальной ориентации листьев и взаимного затенения было обычно пренебрежимо мало. Высокая согласованность с Mini-PAM подтверждает валидность скрининга.

Редкие методические вариации, например затенение малого растения очень крупным соседом, требуют повторного анализа выбросов. Неинвазивность и высокая скорость позволяют повторять измерения тех же растений ежечасно или ежедневно и формировать связанные серии экспериментов.

Интеграция с платформой анализа IAP [37,38] объединяет CFI примерно с 200 признаками NIR/RGB и статической флуоресценции: проекционной площадью, объёмом, архитектурой, цветом и интенсивностью. Эти признаки полезны для роста и стрессовых реакций у Arabidopsis [4,39], кукурузы [4,40], риса [41], чечевицы [42] и ячменя [3,43]. Совместное использование высоты, ширины, компактности и окраски с флуоресцентными показателями позволит исследовать связи архитектуры и фотосинтеза.

Будущая сегментация органов и регистрация 2D/3D дадут карты фотосинтетической функции отдельных листьев в трёхмерной архитектуре. Установленные 3D-лазерные сканеры позволят анализировать ФСII с учётом углов листьев. Точное описание архитектуры необходимо для количественной связи фотосинтеза с приростом биомассы [5]. Скрининг естественной вариабельности — первый шаг к оценке генетического резерва фотосинтетических компонентов урожая [22]. Выбранные образцы будут исследованы подробнее; параметры CFI могут стать количественными признаками для картирования генов, аллелей и маркерной селекции.

Интеграция CFI в автоматизированные высокопроизводительные платформы существенно расширяет набор признаков, обеспечивая совместную оценку архитектуры, биомассы и физиологии, включая ΦPSII. Надёжность подтверждена сравнением с неимиджинговой флуориметрией. Протоколы применимы к модельным и культурным растениям высотой до 1,80 м с различной архитектурой. Высокопроизводительное фенотипирование позволяет глубже анализировать связь архитектуры, биомассы и фотосинтетической эффективности и создаёт возможности для улучшения культур и урожайности.

Образцы Arabidopsis thaliana и пшеницу Triticum aestivum «Kanzler» выращивали при 20/18 °C, влажности 60/75%, PAR=250 мкмоль·м⁻²·с⁻¹, фотопериоде 16/8 ч на смеси 85% красного субстрата 1 и 15% песка. Семена Arabidopsis были массово размножены из линий, гомогенизированных методом одной семени [44], и представляли значительную часть вариации чипа 250K SNP [45].

Кукурузу и табак SNN выращивали в теплице при 25/20 °C, 65% влажности и PAR=350 с 16-часовым светом. Кукурузу предварительно выращивали 5 суток в горшках 9 см на субстрате 2, затем в смеси 40% компоста IPK, 40% субстрата 2 и 20% песка; табак — в той же смеси. Для скрининга кукурузу после 24 ч замачивания проращивали 10 суток в 6-луночных лотках при 15/10 °C, 65% и PAR=250, затем пересаживали в 5-л горшки и выращивали при 10/15 °C 10 суток, 20/17 °C 14 суток и затем 25/20 °C. Образцы происходили из генбанка IPK и панели разнообразия [40].

PAR измеряли квантовым датчиком PAR lite Meteon в центре носителя или панели. Однородность проверяли в 17 точках на 2210 см² крупной системы и пяти точках на 150 см² малой системы; схема точек показана на рисунке 2c–e.

Использовали Mini-PAM с держателем 2060-B для малых растений или 2030-B для кукурузы. ΦPSII=Fq′/Fm′, где Fq′ — разность Fm′ и F′. Fm′ индуцировали 800-мс белым импульсом около 7000 мкмоль·м⁻²·с⁻¹. Актиничный свет внутренней галогенной лампы подавали 10 с с интенсивностью 50–595. Растения адаптировали в туннеле 10 мин; измерения выполняли непосредственно после FluorCam для малых растений или перед ним для крупных при одинаковой интенсивности в туннеле и камере.

Время затвора и чувствительность CCD SN_FC800 подбирали к объекту. ΦPSII измеряли после адаптации и освещения, указанных в результатах. Насыщающий импульс 800 мс имел интенсивность 4100 в малой и 3800 в крупной системе. Световые кривые получали ступенчатым уменьшением актиничного света, по 60 с на ступень. Кажущуюся скорость транспорта электронов рассчитывали:

ETR = ΦPSII × PAR × 0,5 × 0,84,

где 0,5 — средняя доля возбуждения, поступающая к ФСII, а 0,84 — среднее поглощение листа. Поэтому ETRрассматривается как кажущаяся величина.

CCD — прибор с зарядовой связью; DAS — суток после посева; ETR — кажущаяся скорость электронного транспорта ФСII; Fv/Fm — максимальная эффективность ФСII в темноте; HT — высокопроизводительный; IAP — интегрированная платформа анализа; LED — светодиод; NPQ — коэффициент нефотохимического тушения; PAM — импульсно-амплитудная модуляция; PAR — фотосинтетически активная радиация; ФСII — фотосистема II; QA — пластохинон A; ΦPSII — рабочая эффективность ФСII; QTL — локус количественного признака; SD — стандартное отклонение.

HT планировал и выполнял эксперименты и анализировал данные. AJ планировала эксперименты и выполнила скрининг кукурузы. RCM планировала и выполнила скрининг Arabidopsis. HT, AJ и TA написали рукопись. TA руководил проектом. Все авторы прочитали и одобрили окончательный текст.

Авторы благодарят Andrea Apelt, Iris Fischer, Monika Gottowik, Beatrice Knuepfer, Marion Michaelis, Ingo Muecke, AlexandraRech и Gunda Wehrstedt (IPK) за техническую поддержку и Klara Panzarova (PSI) за критическое чтение рукописи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Наборы данных доступны у автора для корреспонденции по обоснованному запросу.

Работа выполнена в рамках German Plant Phenotyping Network (DPPN), финансируемой Федеральным министерством образования и научных исследований Германии, проект 031A053.

urements of ΦPSII (see above) were made after light adap- 1. Arvidsson S, Perez-Rodriguez P, Mueller-Roeber B. A growth phenotyping tation of the plants in adaptation tunnel and subsequent pipeline for Arabidopsis thaliana integrating image analysis and rosette area modelling for robust quantification of genotype effects. New Phytol. to an illumination period in the FluorCam-chamber as 2011;191:895–907. indicated in the results section. Duration of the saturat- 2. Golzarian MR, Frick RA, Rajendran K, Berger B, Roy S, Tester M, Lun DS. ing light pulse to induce F m′ was 800 ms with an inten- Accurate inference of shoot biomass from high-throughput images of cereal plants. Plant Methods. 2011;7:2. sity of 4100 µmol m−2 s−1 (white light) in the system for 3. Neumann K, Klukas C, Friedel S, Rischbeck P, Chen D, Entzian A, Stein N, small plants and 3800 µmol m−2 s−1 in the large system, Graner A, Kilian B. Dissecting spatio-temporal biomass accumulation respectively. Light response curves of the photosynthetic in barley under different water regimes using high-throughput image analysis. Plant Cell Environ. 2015;38:1980–96. electron transport of PSII (ETR) were obtained by a 4. Junker A, Muraya MM, Weigelt-Fischer K, Arana-Ceballos F, Klukas C, stepwise decrease of the actinic light intensity (duration Melchinger AE, Meyer RC, Riewe D, Altmann T. Optimizing experimental of each step 60 s). The apparent rate of ETR was deter- procedures for quantitative evaluation of crop plant performance in high throughput phenotyping systems. Front Plant Sci. 2015. doi:10.3389/ mined as ETR=ΦPSII × PAR × 0.5 × 0.84 where 0.5 is a fpls2014.00770. factor that accounts for the fraction of excitation energy 5. Furbank RT, Quick WP, Sirault XRR. Improving photosynthesis and yield distributed to PSII and the factor 0.84 corresponds to the potential in cereal crops by targeted genetic manipulation: prospects, progress and challenges. Field Crops Res. 2015;182:19–29. leaf absorbance. Both factors are empirical mean factors. 6. Baker NR. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Therefore the results of the ETR calculations are consid- Annu Rev Plant Biol. 2008;59:89–113. ered as apparent. 7. Fiorani F, Rascher U, Jahnke S, Schurr U. Imaging plants dynamics in heterogenic environments. Curr Opin Biotechnol. 2012;23:227–35. 8. Nedbal L, Soukupová J, Kaftan D, Whitmarsh J, Trtílek M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynth Res. Abbreviations 2000;66:3–12. CCD: charge coupled device; DAS: days after sowing; ETR: apparent rate of 9. Rungrat T, Awlia M, Brown T, Cheng R, Sirault X, Fajkus J, Trtilek M, Furbank photosynthetic electron transport of PSII; Fv/Fm: dark-adapted (maximum) PSII B, Badger M, Tester M, Pogson BJ, Borevitz JO, Wilson P. Using phenomic efficiency; HT: high-throughput; IAP: integrated analysis platform; LED: light analysis of photosynthetic function for abiotic stress responses gene emitting diodes; NPQ: non-photochemical quenching coefficient; PAM: pulse discovery. Arabidopsis book. 2016. doi:10.1199/tab.0185. amplitude modulation; PAR: photosynthetic active radiation; PSII: photosystem 10. Schreiber U, Schliwa U, Bilger W. Continuous recording of photochemical II; QA: plastochinone A; ΦPSII: PSII operating efficiency; QTL: quantitative trait and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new loci; SD: standard deviation. type of modulation fluorometer. Photosynth Res. 1986;10:51–62.

11. Bradbury M, Baker NR. Analysis of the slow phases of the in vivo 29. Scholes JD, Rolfe SA. Photosynthesis in localised regions of oat leaves chlorophyll fluorescence induction curve. Changes in the redox state infected with crown rust (Puccina coronata): quantitative imaging of of photosystem II electron acceptors and fluorescence emission from chlorophyll fluorescence. Planta. 1996;199:573–82. photosystem I and II. Biochem Biophys Acta. 1981;635:542–51. 30. Berger S, Papadopoulus M, Schreiber U, Kaiser W, Roitsch T. Complex

12. Quick WP, Horton P. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence regulation of gene expression, photosynthesis and sugar levels by patho- in barley protoplasts. 1. Factors affecting the observation of oscillations gen infection in tomato. Physiol Plant. 2004;122:419–28. in the yield if chlorophyll fluorescence and the rate of oxygen evolution. 31. Chaerle CP, Hagenbeek D, De Bruyne E, Van Der Straeten D. Chlorophyll Proc R Soc B Biol Sci. 1984;220:361–70. fluorescence imaging for disease-resistant screening of sugar beet. Plant

13. Harbinson J, Prinzenberg AE, Kruijer W, Aarts MGM. High throughput Cell Tissue Organ Cult. 2007;91:97–106. screening with chlorophyll fluorescence imaging and its use in crop 32. Scholes JD, Rolfe SA. Chlorophyll fluorescence imaging as tool for improvement. Curr Opin Biotechnol. 2012;23:221–6. understanding the impact of fungal diseases on plant performance; a

14. Murchie EH, Lawson T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to phenomics perspective. Funct Plant Biol. 2009;36:880–92. good practice and understanding some new applications. J Exp Bot. 33. Hirth M, Dietzel L, Steiner S, Ludwig R, Weidenbach H, Pfalz J, 2013;64:3983–98. Pfannschmidt T. Photosynthetic acclimation responses of maize seedlings

15. Genty B, Briantais JM, Baker NR. The relationship between the quantum grown under artificial laboratory light gradients mimicking natural yield of photosynthetic electron-transport and quenching of chlorophyll canopy conditions. Front Plant Sci. 2013. doi:10.3389/fpls.2013.00334. fluorescence. Biochem Biophys Acta. 1989;990:87–92. 34. Slattery RA, Ort DR. Photosynthetic energy conversion efficiency: setting

16. Maxwell K, Johnson GN. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. J Exp a baseline for gauging future improvements in important food and Bot. 2000;51:659–68. biofuel crops. Plant Physiol. 2015;168:383–92.

17. Baker NR, Rosenquist E. Applications of chlorophyll fluorescence can 35. Driever SM, Lawson T, Andralojc PJ, Raines CA, Parry MAJ. Natural variation improve crop production strategies: an examination of future possibili- in photosynthetic capacity, growth and yield in 64 field-grown wheat ties. J Exp Bot. 2004;55:1607–21. genotypes. J Exp Bot. 2014. doi:10.1093/jxb/eru253.

18. Barbagallo RP, Oxborough K, Pallett K, Baker NR. Rapid, non-invasive 36. Lichtenthaler HK, Miehe JA. Fluorescence imaging as a diagnostic tool for screening for perturbations of metabolism and plant growth using plant stress. Trends Plant Sci. 1997;2:316–20. chlorophyll fluorescence imaging. Plant Physiol. 2003;132:485–93. 37. Klukas C, Chen D, Pape JM. Integrated analysis platform: an open-source

19. Jansen M, Gilmer F, Biskup B, Nagel KA, Rascher U, Fischbach A, Briem S, information system for high-throughput phenotyping. Plant Physiol. Dreissen G, Tittmann S, Braun S, De Jaeger I, Metzlaff M, Schurr U, Scharr 2014;165:506–18. H, Walter A. Simultaneous phenotyping of leaf growth and chlorophyll 38. Chen D, Shi R, Pape JM, Klukas C. Predicting plant biomass accumulation fluorescence via GROWSCREEN FLUORO allows detection of stress toler- from image-derived parameters. bioRxiv. 2016. doi:10.1101/046656. ance in Arabidopsis thaliana and other rosette plants. Funct Plant Biol. 39. Harshavardhan VT, Van Son L, Seiler C, Junker A, Weigelt-Fischer K, Klukas 2009;36:902–14. C, Altmann T, Sreenivasulu N, Bäumlein H, Kuhlmann M. AtRD22 and

20. Flood PJ, Kruijer W, Schnabel SK, Van der Schnoor R, Jalink H, Snel AtUSPL1, members of the plant-specific BURP domain family involved JFH, Harbinson J, Aarts MGM. Phenomics for photosynthesis, growth in Arabidopsis thaliana drought tolerance. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/ and reflectance in Arabidopsis thaliana reveals circadian and long- journal.pone.0110065. term fluctuations in heritability. Plant Methods. 2016. doi:10.1186/ 40. Muraya MM, Chu J, Zhao Y, Junker A, Klukas C, Reif JC, Altmann T. Genetic s13007-016-0113-y. variation of growth dynamics in maize (Zea mays L.) revealed through

21. Humplik JF, Lazar D, Fürst T, Husickova A, Hybl M, Spichal L. Automated automated non-invasive phenotyping. Plant J. 2017;89:366–80. integrative high-throughput phenotyping of plant shoots: a case study 41. Schilling S, Gramzow L, Lobbes D, Kirbis A, Weilandt L, Hoffmeier A, of the cold-tolerance of pea (Pisum sativum L.). Plant Methods. 2015. Junker A, Weigelt-Fischer K, Klukas C, Wu F, Meng Z, Altmann T, Theissen doi:10.1186/s13007-015-0063-9. G. Non-canonical structure, function and phylogeny of the B MADS-box

22. Gorbe E, Calatayud A. Applications of chlorophyll fluorescence imaging gene OsMADS30 of rice (Oryza sativa). Plant J. 2015;84:1059–72. technique in horticultural research: a review. Sci Hortic. 2012;138:24–35. 42. Muscolo A, Junker A, Klukas C, Weigelt-Fischer K, Riewe D, Altmann T.

23. Rahbarian R, Khavari-Nejad R, Ganjeali A, Bagheri A, Najafi F. Drought Phenotypic and metabolic responses to drought and salinity of four stress effects on photosynthesis, chlorophyll fluorescence and water rela- contrasting lentil accessions. J Exp Bot. 2015;66:5467–80. tions in tolerant and susceptible chickpea (Cicer areietinum L.) genotypes. 43. Chen D, Neumann K, Friedel S, Kilian B, Chen M, Altmann T, Klukas C. Acta Biol Crac Ser Bot. 2011;53:47–56. Dissecting the phenotypic components of crop plant growth and

24. Mishra KB, Iannacone R, Petrozza A, Mishra A, Armentano N, La Vecchia G, drought responses based on high-throughput image analysis. Plant Cell. Trtilek M, Cellini F, Nedbal L. Engineered drought tolerance in tomato is 2014;26:4636–55. reflected in chlorophyll fluorescence emission. Plant Sci. 2012;182:79–86. 44. Törjek O, Berger D, Meyer RC, Müssig C, Schmid KJ, Rosleff Sörensen

25. Hogewoning SW, Harbinson J. Insights on the development, kinetics and T, Weisshaar B, Mitchell-Olds T, Altmann T. Establishment of a high- variation of photoinhibition using chlorophyll fluorescence imaging of a efficiency SNP-based framework marker set for Arabidopsis. Plant J. chilled variegated leaf. J Exp Bot. 2007;58:453–63. 2003;36:122–40.

26. Ehlert B, Hincha DK. Chlorophyll fluorescence imaging accurately quanti- 45. Atwell S, Huang YS, Vilhjálmsson BJ, Willems G, Horton M, Li Y, Meng D, fies freezing damage and cold acclimation responses in Arabidopsis Platt A, Tarone AM, Hu TT, Jiang R, Wayan Muliyati N, Zhang X, Amer MA, leaves. Plant Methods. 2008. doi:10.1186/1746-4811-4-12. Baxter I, Brachi B, Chory J, Dean C, Debieu M, de Meaux J, Ecker JR, Faure

27. Devacht S, Lootens P, Baert J, Van Waes J, Van Bockstaele E, Roldan-Ruiz N, Kniskern JM, Jones JDG, Michael T, Nemri A, Roux F, Salt DE, Tang C, I. Evaluation of cold stress of young industrial chicory (Cichorium intybus Todesco M, Traw MB, Weigel D, Marjoram P, Borevitz JO, Bergelson J, L.) plants by chlorophyll a fluorescence imaging. 1. Light induction curve. Nordborg M. Genome-wide association study of 107 phenotypes in Photosynthetica. 2011;49:161–71. Arabidopsis thaliana inbred lines. Nature. 2010;465:627–31.

28. Mauromiciale G, Ierna A, Marchese M. Chlorophyll fluorescence and chlorophyll content in field-grown potato as affected by nitrogen supply, genotype, and plant age. Photosynthetica. 2006;44:76–82.