Марек Ковар*, Марек Живчак, Андрей Филачек, Люция Ясеновска, Игор Вукелич, Деяна Панкович, Вилиам Барек, Синхун Ян, Мариан Брестич

Исследовательская статья. Open Agriculture, 2024; 9: 20220331.

DOI: https://doi.org/10.1515/opag-2022-0331

Получено 9 января 2024 г.; принято 2 июля 2024 г.

* Автор для корреспонденции: Марек Ковар, Институт растениеводства и наук об окружающей среде, Словацкий сельскохозяйственный университет, A. Hlinku 2, 94976, Нитра, Словацкая Республика; e-mail: marek.kovar@uniag.sk; тел.: +421-37-641-4440.

Марек Живчак, Андрей Филачек, Люция Ясеновска, Мариан Брестич: Институт растениеводства и наук об окружающей среде, Словацкий сельскохозяйственный университет, Нитра, Словацкая Республика.

Игор Вукелич: факультет экологического сельского хозяйства, Университет Educons, Сремска-Каменица, Сербия. Деяна Панкович: Институт Юлиуса Кюна, Институт исследований устойчивости и стрессоустойчивости, Кведлинбург, Германия. Вилиам Барек: Институт ландшафтной инженерии, Словацкий сельскохозяйственный университет, Нитра, Словацкая Республика. Синхун Ян: Государственная ключевая лаборатория улучшения пшеницы, Колледж наук о жизни, Шаньдунский сельскохозяйственный университет, Тайань, Китай.

Статья открытого доступа. © 2024 Авторы; опубликовано De Gruyter. Лицензия Creative Commons Attribution 4.0 International.

Достижения информатики, робототехники и методов визуализации позволяют использовать современные технологии цифровой реконструкции для высокопроизводительного фенотипирования растений (HTPP), подвергающихся воздействию стрессовых факторов, а также для онтологии их структурных и функциональных признаков. Цифровая визуализация структурных и функциональных особенностей надземной части растений является неразрушающей и позволяет наблюдать растения в течение всего жизненного цикла. В эксперименте с растениями томата (Solanum lycopersicum L., сорт Gruzanski zlatni), выращенными в контролируемых условиях и подвергнутыми постепенному обезвоживанию почвы, с помощью цифровой регистрации оптических сигналов на платформе PlantScreen™ оценивали фенотипические признаки и фенотипическую пластичность.

При точном контроле и мониторинге содержания воды в почве было оценено 25 различных морфофизиологических признаков растения. Разные уровни водообеспеченности обусловили статистически значимые различия в формировании отдельных фенотипических признаков. Выявлены признаки с низкой вариабельностью как в хорошо увлажнённых условиях, так и при водном стрессе, а также признаки с высокой фенотипической пластичностью. Геометрические признаки, особенно Isotop, Round-2top и Compside, характеризовались относительно низкой пластичностью, индуцированной засухой. Напротив, функциональные и хемометрические характеристики ΔF/F′m, Rfd, Water-1 и ARI-1 продемонстрировали способность к быстрой пластической реакции при водном стрессе. Результаты подтверждают, что методология высокопроизводительного фенотипирования в сочетании с современными средствами статистического анализа может успешно применяться для характеристики ответов культур на стресс и выявления признаков стрессоустойчивости.

Ключевые слова: высокопроизводительное фенотипирование; визуализация; флуоресценция хлорофилла; хемометрика; томат; засуха.

Стрессовые воздействия окружающей среды — засуха, суб- и супраоптимальная температура, засоление и другие — существенно влияют на продуктивность растений. В условиях продолжающегося изменения климата засуха относится к наиболее частым ограничениям и приводит к снижению роста, развития и урожая [1]. Актуальность изучения агробиологических последствий засухи для молекулярных, физиологических и урожайформирующих процессов дополнительно усиливается растущей потребностью в продовольствии [2]. Сегодня исследователям реакций растений на стресс, включая засуху, доступно множество сложных инструментов [3]. Развитие различных омикс-технологий открывает новые возможности комплексного описания механизмов реакции растений на стресс [4–6].

Водный стресс влияет на разрастание листьев [7], поведение устьиц [8], фотосинтез, транспирацию, донорно-акцепторные отношения и транслокацию ассимилятов [9–12], что отражается на росте корней и побегов. Реакции растений на засуху сложны. Устойчивость проявляется в удалении активных форм кислорода, осмотической регуляции, изменении липидного состава мембран и гормонального баланса, а также модуляции фотосинтеза и эффективности использования воды [11, 13–16]. Эти свойства широко применяются в физиологии стресса, селекции и агрономии. Однако их количественная оценка трудоёмка, нередко разрушительна, трудно выполняется одновременно и требует опытного персонала [17, 18]. Поэтому необходимы быстрые методы надёжного количественного описания фенотипических признаков и критериев скрининга, отражающих механизмы устойчивости к абиотическому стрессу.

В отличие от современных геномных исследований на основе секвенирования нового поколения, узким местом при отборе биологического материала и оценке индуцированной стрессом пластичности остаётся количественное описание фенома [19, 20]. Современные оптические методы фенотипирования позволяют быстро и неразрушающе исследовать большое число особей и множество структурных и функциональных признаков [17, 21, 22]. Ключевое преимущество HTPP — неразрушающая регистрация оптических сигналов и компьютерное зрение, позволяющие формировать временные ряды измерений отдельных признаков с высоким разрешением и точностью. За последние два десятилетия в мире созданы десятки автоматизированных установок, способных характеризовать продуктивность и фенотипическую пластичность в полностью или частично регулируемых условиях [23–31].

HTPP обеспечивает скрининг стрессоустойчивого материала многих видов посредством количественной оценки архитектуры [27], биомассы [30], фотосинтетической продуктивности [32], эффективности использования воды, света и элементов питания [26, 31], содержания биологически активных веществ [20, 33, 34] и воды [35]. Для арабидопсиса, табака, пшеницы, риса и томата показана высокая корреляция цифровой RGB-оценки площади побега или листьев со свежей и сухой массой надземной части [23, 26, 32]. RGB-фенотипирование позволяет оценивать высоту, компактность и изотропность [36]. Пространственную неоднородность фотосинтеза выявляют по изображениям флуоресценции хлорофилла [37]. Гиперспектральная спектроскопия отражения стала высокоценным методом оценки биологически активных веществ и воды в тканях [33–35, 38].

Платформа PlantScreen™, установленная в Лаборатории продукционной физиологии и экофизиологии растений Исследовательского центра AgroBioTech Словацкого сельскохозяйственного университета в Нитре, объединяет RGB-датчики, регистрацию флуоресценции хлорофилла a и гиперспектральную спектроскопию отражения для количественного описания структурных и функциональных особенностей растений в контролируемой среде. Цель пилотного исследования — показать полезность установки при описании вызванных засухой фенотипических изменений томата, количественно оценить вариабельность данных за весь эксперимент и определить величину фенотипической пластичности по изменениям 25 структурных, функциональных и хемометрических признаков.

Семена томата (Solanum lycopersicum L., сорт Gruzanski zlatni) высевали в пластиковые кассеты (6 × 4 ячейки), заполненные торфяным субстратом TS2 (Klasmann-Deilmann, Гесте, Германия). Проращивание проходило при интенсивности света 250 мкмоль·м⁻²·с⁻¹, фотопериоде 14/10 ч (день/ночь), температуре 25/17 °C и влажности воздуха 60%. После появления всходов растения пересаживали в пластиковые горшки объёмом 5 л с субстратом TS2; 40 горшков зарегистрировали на конвейерной фенотипической платформе PlantScreen™ (PSI, Драсов, Чешская Республика).

Платформа включает помещение для выращивания и блоки оптических датчиков: две RGB-камеры, один флуориметр хлорофилла a и два гиперспектрометра. Конфигурация датчиков и зона выращивания показаны на рис. 1. Опытные лотки с хорошо поливаемыми (WW) и испытывающими водный стресс (WS) растениями располагали по полностью рандомизированной схеме. Для фенотипирования использовали девять растений WW и 15 растений WS.

Растения выращивали 48 суток в полностью регулируемых условиях: интенсивность света 1000 мкмоль·м⁻²·с⁻¹; холодный белый, тёмно-красный и дальний красный свет составляли соответственно 80, 10 и 10% общей интенсивности, измеренной спектрофотометром SpectraPen mini; фотопериод 14/10 ч; температура 25/17 °C; влажность 40–53%; концентрация CO₂ 350–400 ppm. Параметры среды представлены на рис. 2. Полив контролировали гравиметрически с точностью ±2,0 г на весовой и оросительной станции PlantScreen™, поддерживая 70% полной влагоёмкости почвы (контрольная масса 1490 г). Такие растения обозначали WW.

После девяти суток акклиматизации и появления третьего полностью развитого листа у случайно выбранных растений WS прекращали полив до снижения содержания воды в почве (SWC) до 15%. SWC рассчитывали по формуле:

где WW — влажная масса субстрата, DW — сухая масса после высушивания при 105 °C до постоянной массы. WW определяли через 10 ч после полного полива до 100% полевой влагоёмкости [39].

Сбор изображений программировали в PlantScreen™ Scheduler. RGB-съёмку выполняли через день двумя камерами сверху и сбоку. Цветные изображения 5 Мп регистрировали сверху и сбоку под углами 0 и 90°. Кадры 2560 × 1920 пикселей сохраняли в базе и обрабатывали в PlantScreen™ Data Analyzer.

Количественное измерение флуоресценции хлорофилла a позволяет оценивать эффективность первичных фотосинтетических реакций в разных условиях. Фотосинтетическую продуктивность в среднем каждые четыре суток определяли по изображениям флуоресценции (CF) флуориметром FluorCam FC-800MF, работавшим в импульсно-амплитудном режиме. Ночью с 22:00 растения помещали в блок CF в темноадаптированном состоянии фотосистемы II. Для расчёта применяли протокол анализа тушения с холодным белым актиничным светом 600 мкмоль·м⁻²·с⁻¹.

Для гиперспектрального анализа отражения сверху применяли спектрометры видимого и ближнего ИК-диапазона (VNIR) и коротковолнового ИК-диапазона (SWIR). До съёмки выполняли тёмную и световую калибровку по пластине Spectralon. Оба спектрометра формировали двумерный пространственный массив спектральных векторов для каждого пикселя; итоговый трёхмерный куб данных содержал две пространственные оси x, y и спектральную ось z. Растения освещали галогенной трубкой 600 Вт с цветовой температурой 2600 К. VNIR- и SWIR-датчики работали как линейные сканеры.

Для RGB PlantScreen™ Data Analyzer выполнял три этапа выделения растений и расчёта ростовых и морфологических параметров. Сначала автоматически корректировалась бочкообразная дисторсия, удалялся фон и непринадлежащие растению пиксели, бинаризацией создавалась маска, затем изображение реконструировалось в естественных и искусственных цветах. Второй этап включал расчёт площади и морфологических параметров. Предварительная обработка CF состояла из применения маски, вычитания фона и попиксельного расчёта параметров флуоресценции. Данные VNIR и SWIR обрабатывали попиксельно: радиометрическая калибровка и поправка тёмного шума, вычитание фона и автоматический расчёт вегетационных индексов. Маску растения строили из VNIR-куба по формуле:

где R₇₄₀, R₆₇₂ и R₅₅₆ — интенсивности отражения при 740, 672 и 556 нм. Расчёты и краткие описания геометрических, структурных и хемометрических параметров приведены в табл. 2.

Скорость эвапотранспирации (ET, г H₂O·дм⁻²·сут⁻¹) для каждого растения и каждого дня рассчитывали по формуле [40]:

где W_A — масса горшка до полива в день tᵢ, W_B — масса после дня tᵢ₋₁, A — площадь надземной части в момент tᵢ, tᵢ — интересующий день, tᵢ₋₁ — предыдущий день.

Таблица 2. Описание структурных, функциональных и хемометрических признаков

Данные структурных и функциональных признаков анализировали в Statistica 10, пакете statgenHTP и средствами Outlier Detection Methods проекта EPPN2020 в RStudio. Сначала применяли критерий Граббса для выявления выбросов между биологическими повторностями каждого генотипа и варианта по Poudel et al. [41]. Порог выбросов и экстремальных значений устанавливали как 2·SD. Однородность и нормальность распределения проверяли тестами Левена и Кохрана. Статистически значимые различия оценивали дисперсионным анализом (ANOVA) при уровне 0,05, затем критерием Тьюки и обозначали p < 0,05, 0,01 и 0,001.

Корреляции между признаками оценивали коэффициентом Пирсона (rP). Степень вариабельности рассчитывали как безразмерный коэффициент вариации:

где σ — стандартное отклонение, μ — среднее. Фенотипическую пластичность отдельного признака (PhP) рассчитывали [42]:

где xᵢWW — среднее значение признака у WW, xᵢWS — у WS.

Реализация генетической информации в онтогенетической программе и формирование фенотипа происходят в непосредственной связи и взаимодействии со средой. Долгосрочная цель биологов и физиологов растений — неинвазивно изучать и интерпретировать структурную и функциональную динамику. Цифровое фенотипирование становится популярным средством количественного описания признаков, особенно связанных с продукцией биомассы и стрессоустойчивостью. Неотъемлемая часть описания фенотипа — знание микроклиматических условий роста и развития.

На стадии третьего полностью развитого листа (9 DAE) прекращали полив и начинали цикл обезвоживания субстрата (рис. 3а). У WW поддерживали SWC 70%. У WS он непрерывно снижался и после 17 суток достиг 15%, что соответствует средней потере воды 3,2%. Медленное постепенное обезвоживание позволяет растениям формировать защитные реакции и повышать засухоустойчивость [11, 42].

Засухоустойчивость считается «комплексным признаком» [43]; важнейшие её компоненты обеспечивают гидратацию и тургор тканей. Тургор играет существенную роль в росте, развитии, механической опоре, сигнализации, движениях органов, цветении и ответе на стресс [44]. В ходе эволюции растения сформировали стратегии преодоления засухи через фенотипическую пластичность [45]. Чем выше индуцированная стрессом PhP, тем заметнее различие фенотипа WW и WS. Двадцать пять признаков разделили на структурные, функциональные и хемометрические (табл. 3).

Скорость роста площади WW имела типичную сигмоидальную форму; площадь надземной части достигла 22,96 дм². Засуха статистически значимо замедляла рост, а фенотипические различия были визуально заметны уже на 25 DAE (рис. 3в). Она существенно нарушала формирование вертикальной архитектуры. Высота H, компактность Comptop и тонкость листьев SOL — важные геометрические параметры, чувствительно отражающие нарушения роста и динамику листовой площади. Их проявление было относительно однородным внутри условий WW и WS, о чём свидетельствуют низкий C.V. 0,04–0,15 и высокий partial η². У взрослых томатов геометрия и вертикальная структура сложнее, чем у растений на ювенильных стадиях [46], видов с малым числом листьев [47] либо листовой розеткой [36].

С помощью точной весовой и оросительной станции рассчитывали ET в онтогенезе (рис. 4) с двухсуточным интервалом для выяснения причин физиологических и морфологических реакций. В начале онтогенеза испарение растением и почвой составляло 147 ± 11 г H₂O·дм⁻²·сут⁻¹. По мере увеличения листовой площади ET существенно снижалась — почти на 35% даже у WW, что может быть связано с формированием кутикулы [48], оптимизацией работы устьиц [49] и уменьшением испарения с поверхности почвы. При SWC 15% у WS ET составляла 20 ± 5 г·дм⁻²·сут⁻¹. Сходную онтогенетическую динамику наблюдали у пшеницы [32], но одновременное фенотипирование и цифровая оценка листовой площади позволяют рассчитывать потери воды на единицу площади.

Хотя RGB-фенотипирование широко используется для структурного описания множества видов, комплексных исследований анатомических признаков визуального проявления морфологии немного. Помимо воды в почве, важную роль в формировании анатомии и морфологии играет дефицит давления водяного пара (VPD). Amitrano et al. [50] объединили визуальное фенотипирование с углублённым анатомическим анализом при изучении реакций салата на засуху и VPD.

Метод флуоресценции успешно применяется в фундаментальных исследованиях фотосинтеза и селекционном скрининге [10, 51]. Динамика функциональных признаков фотосинтеза показана на рис. 5. Минимальная Fo и максимальная Fm интенсивность флуоресценции в онтогенезе WW слегка возрастали. Обычная реакция на засуху — снижение обоих показателей. У WS статистически значимое (p < 0,001) снижение Fo и Fm наблюдалось с 16-го дня водного стресса, причём Fo реагировал быстрее и чувствительнее. Реакция акклимации связана с фотозащитными механизмами и/или повреждением фотосистемы II [52].

Максимальная фотохимическая эффективность PSII Fv/Fm — хороший индикатор реакции на стресс [51], но у многих видов, включая томат, она стабильна при умеренной засухе и снижается только при сильной [53, 54]. В первой фазе онтогенеза Fv/Fm немного превысила 0,830. У WS снижение началось лишь на 21-й день обезвоживания, после десяти суток при SWC 15%. В конце цикла показатель статистически значимо упал до 0,780 ± 0,018.

Полноэкранная визуализация флуоресценции даёт среднее Fv/Fm для целого растения [24], однако подтвердила неоднородность между листьями. Более чувствительный показатель первичных реакций — фактическая фотохимическая эффективность ΔF/F′m. У WW она возрастала в онтогенезе, а у WS снижение наблюдалось уже на пятые сутки обезвоживания (p < 0,001). ΔF/F′m отражает и максимальную эффективность PSII при актиничном свете, и тепловое рассеяние энергии посредством NPQ. Наивысший NPQ наблюдался у ювенильных растений (1,40 ± 0,10). В онтогенезе он сильнее снижался при стрессе: 0,924 ± 0,101 у WW против 0,590 ± 0,129 у WS. Значимое отличие проявилось на одиннадцатые сутки засухи. Формирование ассимиляционной поверхности сопровождалось снижением NPQ, а визуализация эффективно показывала физиологические процессы и неоднородность. Тепловое рассеяние было активнее в молодых верхних листьях, чем в старых нижних; эти результаты дополняют сведения о видоспецифических онтогенетических изменениях NPQ [55, 56].

Rfd — относительное снижение флуоресценции — прямо коррелирует с чистой ассимиляцией CO₂ у многих растений [57]. Как и NPQ, максимальный Rfd наблюдался у ювенильного томата (2,016 ± 0,138). До 22 DAE общий уровень быстро снижался, затем оставался стабильным у WW и WS. Водный стресс значимо снижал Rfd (p < 0,001), причём активность была выше в молодых листьях.

Гиперспектральное отражение — эффективное средство количественной оценки изменений биологически значимых веществ в листьях при стрессе [12, 33, 35]. Неразрушающая хемометрика с VNIR- и SWIR-датчиками PlantScreen™ позволила оценить кинетику содержания воды Water-1, ассимиляционных пигментов NDVI и MCARI-1, хлорофилла a CHLa, каротиноидов CRI-1 и антоцианов ARI-1. По мере усиления засухи Water-1 возрастал и сильно отрицательно коррелировал с SWC (rP = −0,84; p < 0,001); внутри вариантов наблюдалась низкая вариабельность. Это показывает, что SWIR точнее VNIR-индексов при оценке воды [35]. NDVI и MCARI-1 имели наименьшую пластичность среди хемометрических параметров, тогда как засуха почти втрое повысила концентрацию антоцианов ARI-1.

Важное преимущество автоматических платформ, измеряющих множество морфологических и физиологических параметров, — количественная оценка PhP. Фенотипическая пластичность — способность организма к обратимым морфологическим, биохимическим или физиологическим изменениям в ответ на среду [45]. Некоторые геометрические признаки имели относительно низкую вызванную засухой PhP: Isotop, Round-2top и Compside от −9,57 до −26,03, хотя эти значения выше опубликованных ранее [46]. Отрицательная PhP означает снижение признака при засухе.

В отличие от геометрических признаков, функциональные и хемометрические способны быстро изменяться в WS. Особенно это относится к CHLa, CRI-1 и ARI-1 с PhP 50–300, определяемой силой и продолжительностью стресса. Оценка пластичности морфологических и физиологических признаков применима в селекции засухоустойчивых томатов [11, 49, 58]. Отбор генотипов по менее пластичным признакам может повысить производительность в засуху.

Чувствительность цифрового фенотипирования подтверждена корреляционным анализом: ET, A и Water-1 очень тесно зависели от SWC (rP > 0,80; p < 0,001). Другие морфологические признаки Comp, Round, RMS, Ecc и Iso коррелировали слабее (rP = 0,20–0,40), за исключением высоты (rP = 0,63; p < 0,001). Функциональные показатели эффективности фотосинтеза сильно зависели от SWC (rP = 0,50–0,73; p < 0,001), кроме Fv/Fm (rP = 0,17).

Современное высокопроизводительное фенотипирование растений позволяет одновременно оценивать множество признаков. На примере томата показано, что цифровая визуализация и расчёт структурных и функциональных параметров имеют ряд преимуществ перед классическими методами описания фенотипа. Регистрация оптических сигналов неинвазивна и неразрушающа и позволяет оценивать фенотип на протяжении онтогенеза. Система формирует базы морфофизиологических признаков, доступные для повторного анализа и обмена. Одновременный расчёт нескольких независимых параметров повышает общую прогностическую ценность фенотипа, реализованного в конкретной среде.

Исследование выявило статистически значимую сложность морфологических и физиологических реакций томата на водный стресс. Геометрические признаки Isotop, Round-2top и Compside имели сравнительно низкую PhP. Функциональные и хемометрические характеристики ΔF/F′m, Rfd, Water-1 и ARI-1, напротив, способны быстро изменяться при WS. Эксперименты подтвердили надёжность и воспроизводимость неразрушающей высокопроизводительной количественной оценки отдельных морфофизиологических признаков между повторностями (C.V. до 0,20), особенно в WS. Оценка вариабельности WW и WS, фенотипической пластичности и корреляций указывает на огромный потенциал цифрового фенотипирования растений при стрессах.

Исследование поддержано проектами Словацкого агентства исследований и разработок APVV-SK-SRB-21-0043, APVV-20-0071 и APVV SK-CN-21-0045.

Все авторы приняли ответственность за содержание рукописи, согласились с её подачей, рассмотрели результаты и одобрили опубликованную версию. MK и MŽ — методология; MK, MŽ и IV — программное обеспечение; MK — валидация; MK, AF и LJ — формальный анализ; MK — исследование; MK и IV — ресурсы; MK, IV и DP — курирование данных; MK — подготовка первоначального текста; MŽ, MB и XY — рецензирование и редактирование; MK — визуализация; MB и DP — руководство; MB, VB и XY — администрирование проекта и привлечение финансирования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Совместное использование данных к данной статье неприменимо, поскольку в ходе исследования наборы данных не создавались и не анализировались.

Библиографические записи воспроизводятся в исходном виде для сохранения точных названий, наименований журналов и DOI.

[1] Tardieu F, Simonneau T, Muller B. The physiological basis of drought tolerance in crop plants: A scenario-dependent probabilistic approach. Annu Rev Plant Biol. 2018;69(1):733–59. doi: 10.1146/ annurev-arplant-042817-040218.

[2] Wheeler T, von Braun J. Climate change impacts on global food security. Science. 2013;341(6145):508–13. doi: 10.1126/science.1239402.

[3] Bashir SS, Hussain A, Hussain SJ, Wani OA, Zahid Nabi S, Dar NA, et al. Plant drought stress tolerance: Understanding its physiological, biochemical and molecular mechanisms. Biotechnol & Biotechnol Equip. 2021;35(1):1912–25. doi: 10.1080/13102818.2021. 2020161.

[4] Lozano-Elena F, Fàbregas N, Coleto-Alcudia V, Caño-Delgado AI. Analysis of metabolic dynamics during drought stress in arabidopsis plants. Sci Data. 2022;9(1):90. doi: 10.1038/s41597-022-01161-4.

[5] Cardoso LL, Freire FBS, Daloso DM. Plant metabolic networks under stress: A multi-species/stress condition meta-analysis. J Soil Sci Plant Nutr. 2023;23(1):4–21. doi: 10.1007/s42729-022-01032-2.

[6] Favreau B, Gaal C, Pereira de Lima I, Droc G, Roques S, Sotillo A, et al. A multi-level approach reveals key physiological and molecular traits in the response of two rice genotypes subjected to water deficit at the reproductive stage. Plant-Environ Interact. 2023;4(5):229–57. doi: 10.1002/pei3.10121.

[7] Koch G, Rolland G, Dauzat M, Bédiée A, Baldazzi V, Bertin N, et al. Leaf production and expansion: A generalized response to drought stresses from cells to whole leaf biomass – A case study in the tomato compound leaf. Plants. 2019;8(10):409. doi: 10.3390/ plants8100409.

[8] Li S, Liu J, Liu H, Qiu R, Gao Y, Duan A. Role of hydraulic signal and ABA in decrease of leaf stomatal and mesophyll conductance in soil drought-stressed tomato. Front Plant Sci. 2021;12:653186. doi: 10. 3389/fpls.2021.653186.

[9] Chaves MM, Flexas J, Pinheiro C. Photosynthesis under drought and salt stress: Regulation mechanisms from whole plant to cell. Ann Bot. 2009;103(4):551–60. doi: 10.1093/aob/mcn125.

[10] Kalaji HM, Jajoo A, Oukarroum A, Brestic M, Zivcak M, Samborska IA, et al. Chlorophyll a fluorescence as a tool to monitor physiological status of plants under abiotic stress conditions. Acta Physiol Plant. 2016;38(4):102. doi: 10.1007/s11738-016-2113-y.

[11] Liang G, Liu J, Zhang J, Guo J. Effects of drought stress on photosynthetic and physiological parameters of tomato. J Am Soc Hortic Sci. 2020;145(1):12–7. doi: 10.21273/JASHS04725-19.

[12] Yang X, Li Y, Chen H, Huang J, Zhang Y, Qi M, et al. Photosynthetic response mechanism of soil salinity-induced cross-tolerance to subsequent drought stress in tomato plants. Plants. 2020;9(3):363. doi: 10.3390/plants9030363.

[13] Blum A. Osmotic adjustment is a prime drought stress adaptive engine in support of plant production. Plant Cell Environ. 2017;40(1):4–10. doi: 10.1111/pce.12800.

[14] Gupta A, Rico-Medina A, Caño-Delgado AI. The physiology of plant responses to drought. Science. 2020;368(6488):266–9. doi: 10.1126/ science.aaz7614.

[15] Sousaraei N, Mashayekhi K, Mousavizadeh SJ, Akbarpour V, Medina J, Aliniaeifard S. Screening of tomato landraces for drought tolerance based on growth and chlorophyll fluorescence analyses. Hortic Env Biotechnol. 2021;62(4):521–35. doi: 10.1007/s13580-02000328-5.

[16] Conti V, Parrotta L, Romi M, Del Duca S, Cai G. Tomato biodiversity and drought tolerance: A multilevel review. Int J Mol Sci. 2023;24(12):10044. doi: 10.3390/ijms241210044.

[17] Furbank RT, Tester M. Phenomics – Technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 2011;16(12):635–44. doi: 10.1016/j.tplants.2011.09.005.

[18] Rebetzke GJ, Jimenez-Berni J, Fischer RA, Deery DM, Smith DJ. Review: High-throughput phenotyping to enhance the use of crop genetic resources. Plant Sci. 2019;282:40–8. doi: 10.1016/j.plantsci. 2018.06.017.

[19] Watt M, Fiorani F, Usadel B, Rascher U, Muller O, Schurr U. Phenotyping: New windows into the plant for breeders. Annu Rev Plant Biol. 2020;71(1):689–712. doi: 10.1146/annurev-arplant-042916-041124.

[20] Yang W, Feng H, Zhang X, Zhang J, Doonan JH, Batchelor WD, et al. Crop phenomics and high-throughput phenotyping: Past decades, current challenges, and future perspectives. Mol Plant. 2020;13(2):187–214. doi: 10.1016/j.molp.2020.01.008.

[21] Fiorani F, Schurr U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu Rev Plant Biol. 2013;64(1):267–91. doi: 10.1146/annurev-arplant050312-120137.

[22] Poorter H, Hummel GM, Nagel KA, Fiorani F, von Gillhaussen P, Virnich O, et al. Pitfalls and potential of high-throughput plant phenotyping platforms. Front Plant Sci. 2023;14:1233794. doi: 10. 3389/fpls.2023.1233794.

[23] Granier C, Aguirrezabal L, Chenu K, Cookson SJ, Dauzat M, Hamard P, et al. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. N Phytol. 2006;169(3):623–35. doi: 10.1111/j.1469-8137.2005.01609.x.

[24] Jansen M, Gilmer F, Biskup B, Nagel KA, Rascher U, Fischbach A, et al. Simultaneous phenotyping of leaf growth and chlorophyll fluorescence via GROWSCREEN FLUORO allows detection of stress tolerance in Arabidopsis thaliana and other rosette plants. Funct Plant Biol. 2009;36(11):902–14. doi: 10.1071/FP09095.

[25] Nagel KA, Putz A, Gilmer F, Heinz K, Fischbach A, Pfeifer J, et al. GROWSCREEN-rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct Plant Biol. 2012;39(11):891–904. doi: 10.1071/FP12023.

[26] Chen D, Neumann K, Friedel S, Kilian B, Chen M, Altmann T, et al. Dissecting the phenotypic components of crop plant growth and drought responses based on high-throughput image analysis. Plant Cell. 2014;26(12):4636–55. doi: 10.1105/tpc.114.129601.

[27] Klukas C, Chen D, Pape J-M. Integrated analysis platform: An opensource information system for high-throughput plant phenotyping. Plant Physiol. 2014;165(2):506–18. doi: 10.1104/pp.113.233932.

[28] Al-Tamimi N, Brien C, Oakey H, Berger B, Saade S, Ho YS, et al. Salinity tolerance loci revealed in rice using high-throughput noninvasive phenotyping. Nat Commun. 2016;7(1):13342. doi: 10.1038/ ncomms13342.

[29] Asaari MSM, Mertens S, Dhondt S, Inzé D, Wuyts N, Scheunders P. Analysis of hyperspectral images for detection of drought stress and recovery in maize plants in a high-throughput phenotyping platform. Computers Electron Agric. 2019;162:749–58. doi: 10.1016/ j.compag.2019.05.018.

[30] Li D, Quan C, Song Z, Li X, Yu G, Li C, et al. High-throughput plant phenotyping platform (HT3P) as a novel tool for estimating agronomic traits from the lab to the field. Front Bioeng Biotechnol. 2021;13(8):623705. doi: 10.3389/fbioe.2020.623705.

[31] Ngo HTT, Cavagnaro TR, Jewell N, Brien CJ, Berger B, WattsWilliams SJ. High-throughput shoot phenotyping reveals temporal growth responses to nitrogen and inorganic and organic phosphorus sources in tomato. AoB Plants. 2023;15(2):plad011. doi: 10. 1093/aobpla/plad011.

[32] Correia PMP, Cairo Westergaard J, Bernardes da Silva A, Roitsch T, Carmo-Silva E, Marques da Silva J. High-throughput phenotyping of physiological traits for wheat resilience to high temperature and drought stress. J Exp Bot. 2022;73(15):5235–51. doi: 10.1093/jxb/ erac160.

[33] Corti M, Marino Gallina P, Cavalli D, Cabassi G. Hyperspectral imaging of spinach canopy under combined water and nitrogen stress to estimate biomass, water, and nitrogen content. Biosyst Eng. 2017;158:38–50. doi: 10.1016/j.biosystemseng. 2017.03.006.

[34] Sytar O, Brestic M, Zivcak M, Olsovska K, Kovar M, Shao H, et al. Applying hyperspectral imaging to explore natural plant diversity towards improving salt stress tolerance. Sci Total Environ. 2017;578:90–9. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.08.014.

[35] Kovar M, Brestic M, Sytar O, Barek V, Hauptvogel P, Zivcak M. Evaluation of hyperspectral reflectance parameters to assess the leaf water content in soybean. Water. 2019;11(3):443. doi: 10.3390/ w11030443.

[36] de Vylder J, Vandenbussche F, Hu Y, Philips W, Van Der Straeten D. Rosette tracker: An open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiol. 2012;160(3):1149–59. doi: 10.1104/pp.112.202762.

[37] Tschiersch H, Junker A, Meyer RC, Altmann T. Establishment of integrated protocols for automated high throughput kinetic chlorophyll fluorescence analyses. Plant Methods. 2017;13(1):54. doi: 10.1186/s13007-017-0204-4.

[38] Jiang L, Sun L, Ye M, Wang J, Wang Y, Bogard M, et al. Functional mapping of N deficiency-induced response in wheat yield-component traits by implementing high-throughput phenotyping. Plant J. 2019;97(6):1105–19. doi: 10.1111/tpj.14186.

[39] Berger B, de Regt B, Tester M. High-throughput phenotyping of plant shoots. In: Normanly J, editor. High-throughput phenotyping in plants: Methods and protocols. Totowa, NJ: Methods in Molecular Biology; Humana Press; 2012. p. 9–20. doi: 10.1007/9781-61779-995-2_2.

[40] Morota G, Jarquin D, Campbell MT, Iwata H. Statistical methods for the quantitative genetic analysis of high-throughput phenotyping data. Methods Mol Biol. 2022;2539:269–96. doi: 10.1007/978-10716-2537-8_21.

[41] Poudel S, Adhikari B, Dhillon J, Reddy KR, Stetina SR, Bheemanahalli R. Quantifying the physiological, yield, and quality plasticity of southern USA soybeans under heat stress. Plant Stress. 2023;9:100195. doi: 10.1016/j.stress.2023.100195.

[42] Fang Y, Xiong L. General mechanisms of drought response and their application in drought resistance improvement in plants. Cell Mol Life Sci. 2015;72(4):673–89. doi: 10.1007/s00018-014-1767-0.

[43] Blum A. Drought resistance – Is it a complex trait? Funct Plant Biol. 2011;38(10):753–7. doi: 10.1071/FP11101.

[44] Fricke W. Turgor pressure. In: Encyclopedia of life sciences. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd; 2017. p. 1–6. doi: 10.1002/ 9780470015902.a0001687.pub2.

[45] Gratani L. Plant phenotypic plasticity in response to environmental factors. Adv Bot. 2014;2014:e208747. doi: 10.1155/2014/208747.

[46] Janni M, Coppede N, Bettelli M, Briglia N, Petrozza A, Summerer S, et al. In vivo phenotyping for the early detection of drought stress in tomato. Plant Phenomics. 2019;2019:6168209. doi: 10.34133/ 2019/6168209.

[47] Junker A, Muraya MM, Weigelt-Fischer K, Arana-Ceballos F, Klukas C, Melchinger AE, et al. Optimizing experimental procedures for quantitative evaluation of crop plant performance in high throughput phenotyping systems. Front Plant Sci. 2015;5:770. doi: 10.3389/fpls.2014.00770.

[48] Bi H, Kovalchuk N, Langridge P, Tricker PJ, Lopato S, Borisjuk N. The impact of drought on wheat leaf cuticle properties. BMC Plant Biol. 2017;17(1):85. doi: 10.1186/s12870-017-1033-3. Digital imaging of tomato plants under drought  13

[49] Zhou R, Kong L, Wu Z, Rosenqvist E, Wang Y, Zhao L, et al. Physiological response of tomatoes at drought, heat and their combination followed by recovery. Physiol Plant. 2019;165(2):144–54. doi: 10.1111/ppl.12764.

[50] Amitrano C, Junker A, D’Agostino N, De Pascale S, De Micco V. Integration of high-throughput phenotyping with anatomical traits of leaves to help understanding lettuce acclimation to a changing environment. Planta. 2022;256:68. doi: 10.1007/s00425-02203984-2.

[51] Baker NR. Chlorophyll fluorescence: A probe of photosynthesis in vivo. Annu Rev Plant Biol. 2008;59(1):89–113. doi: 10.1146/annurev. arplant.59.032607.092759.

[52] Banks JM. Chlorophyll fluorescence as a tool to identify drought stress in acer genotypes. Environ Exp Botany. 2018;155:118–27. doi: 10.1016/j.envexpbot.2018.06.022.

[53] Živčák M, Brestič M, Olšovská K, Slamka P. Performance index as a sensitive indicator of water stress in Triticum aestivum L. Plant Soil Environ. 2008;54(4):133–9. doi: 10.17221/392-PSE.

[54] Moles TM, Mariotti L, De Pedro LF, Guglielminetti L, Picciarelli P, Scartazza A. Drought induced changes of leaf-to-root relationships in two tomato genotypes. Plant Physiol Biochem. 2018;128:24–31. doi: 10.1016/j.plaphy.2018.05.008.

[55] Carvalho FEL, Ware MA, Ruban AV. Quantifying the dynamics of light tolerance in arabidopsis plants during ontogenesis. Plant Cell Environ. 2015;38(12):2603–17. doi: 10.1111/pce.12574.

[56] Ghorbanzadeh P, Aliniaeifard S, Esmaeili M, Mashal M, Azadegan B, Seif M. Dependency of growth, water use efficiency, chlorophyll fluorescence, and stomatal characteristics of lettuce plants to light intensity. J Plant Growth Regul. 2021;40(5):2191–207. doi: 10.1007/ s00344-020-10269-z.

[57] Lichtenthaler HK, Buschmann C, Knapp M. How to correctly determine the different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio RFd of leaves with the PAM fluorometer. Photosynthetica. 2005;43(3):379–93. doi: 10. 1007/s11099-005-0062-6.

[58] Conti V, Romi M, Parri S, Aloisi I, Marino G, Cai G, et al. Morphophysiological classification of Italian tomato cultivars (Solanum Lycopersicum L.) according to drought tolerance during vegetative and reproductive growth. Plants. 2021;10(9):1826. doi: 10.3390/ plants10091826.