Марек Ковар*, Марек Живчак, Андрей Филачек, Люция Ясеновска, Игорь Вукелич, Деяна Панкович, Вилиам Барек, Синхун Ян, Мариан Брестич

Получена 9 января 2024 г.; принята 2 июля 2024 г.

Аннотация: Достижения в области информатики, робототехники и методов визуализации позволяют использовать передовые технологии цифровой реконструкции для высокопроизводительного фенотипирования растений (HTTP), подверженных воздействию стрессовых факторов, а также для онтологии их структурных и функциональных признаков. Цифровая визуализация структурных и функциональных особенностей надземной части растений является неразрушающей, и растения можно отслеживать на протяжении всего их жизненного цикла. В эксперименте с растениями томата (Solanum lycopersicum L.; сорт Gruzanski zlatni), выращенными в контролируемых условиях окружающей среды и подверженными постепенному обезвоживанию почвы, мы оценивали фенотипические признаки и фенотипическую пластичность с помощью платформы PlantScreen™, используя цифровую визуализацию оптических сигналов растений. В этом исследовании 25 различных морфофизиологических признаков растений были оценены в ходе точного контроля и мониторинга содержания воды в почве. Различные уровни водоснабжения растений вызвали статистически значимые различия в формировании отдельных фенотипических признаков. Было идентифицировано несколько признаков растений, характеризующихся низкой изменчивостью как в условиях хорошего увлажнения, так и в условиях водного стресса, а также признаки с высокой фенотипической пластичностью. Геометрические признаки (особенно Isotoptop, Round-2toptop и Compsideside) показали относительно низкий уровень индуцированной засухой фенотипической пластичности. Однако функциональные и хемометрические характеристики (ΔF/FmΔF/Fm, Rfd, Water-1 и ARI-1) показали потенциал для быстрой пластичности в условиях водного стресса. Наши результаты подтвердили, что методология высокопроизводительного фенотипирования в сочетании с передовыми статистическими инструментами может быть успешно применена для характеристики стрессовых реакций сельскохозяйственных культур и выявления признаков, связанных с устойчивостью к стрессу.

Ключевые слова: высокопроизводительное фенотипирование, визуализация, хлорофилльная флуоресценция, хемометрика, томат, засуха

Стрессовые ситуации окружающей среды, такие как засуха, суб- и супраоптимальная температура, засоление и т.д., значительно влияют на продуктивность растений. Засуха в контексте текущего изменения климата является одним из наиболее часто встречающихся ограничений, приводящих к снижению роста, развития и урожайности растений [1]. Актуальность изучения агробиологических последствий засухи на молекулярные, физиологические и урожайно-формирующие процессы сельскохозяйственных культур также усугубляется растущей потребностью в продуктах питания [2]. В настоящее время исследователям, изучающим реакции растений на различные стрессовые ситуации, включая засуху, доступно множество сложных инструментов [3]. Достижения в области различных омиксных технологий открывают новые возможности для всестороннего описания механизмов реакций растений на стресс [4–6].

При стрессовом воздействии засухи поражаются многие физиологические процессы, такие как расширение листьев [7], поведение устьиц [8], фотосинтез, транспирация, соотношение источник-акцептор и перемещение ассимилятов [9–12], что приводит к изменению роста как корней, так и побегов. Наблюдается сложность реакций растений на засуху. Устойчивость растений к засухе проявляется такими эффектами, как удаление активных форм кислорода, осмотическая регуляция, изменения в составе мембранных липидов и гормональном балансе, а также модуляция фотосинтеза и эффективности использования воды [11,13–16]. Эти характеристики устойчивости растений к засухе широко используются в физиологии стресса растений, селекции сельскохозяйственных культур и агрономии. Однако количественная оценка этих признаков требует много времени, часто является разрушительной, её трудно проводить одновременно, и она требует квалифицированного персонала (например, [17,18]). Это основные причины, по которым мы ищем новые, быстрые и эффективные методы, которые позволят надёжно количественно описывать фенотипические признаки растений и критерии скрининга, отражающие механизмы устойчивости растений к абиотическим стрессовым ситуациям.

В отличие от современных геномных анализов с использованием секвенирования нового поколения, узким местом в отборе биологического материала и стресс-индуцированной фенотипической пластичности является количественное описание фенотипа растений [19,20]. Недавний прогресс в создании и применении оптических методов фенотипирования растений позволяет неразрушающе и быстро оценивать большое количество особей, а также многие структурные и функциональные признаки растений [17,21,22]. Ключевым преимуществом высокопроизводительного фенотипирования растений (HTTP) является неразрушающая визуализация и компьютерное зрение оптических сигналов растений, что позволяет создавать временные ряды измерений отдельных признаков растений с высоким разрешением и точностью. За последние два десятилетия во всём мире было создано множество автоматизированных фенотипирующих установок, способных характеризовать продуктивность растений и фенотипическую пластичность в различных полностью регулируемых или полурегулируемых условиях окружающей среды [23–31]. HTTP позволяют проводить скрининг биологического материала многих видов растений, устойчивых к стрессовым ситуациям, сосредоточившись на количественной оценке архитектуры [27] и признаков, связанных с биомассой [30], фотосинтетической продуктивности [32], эффективности использования воды, света и питательных веществ соответственно [26,31], содержания биологически активных веществ [20,33,34] и воды [35] и т.д. Высокие корреляции между цифровым RGB-определением площади побега или листьев и весом свежей/сухой биомассы побегов были зарегистрированы для многих растений, включая Arabidopsis, табак, пшеницу, рис и томат [23,26,32]. RGB-фенотипирование также позволяет оценивать многие морфометрические признаки растений, такие как высота, компактность или изотропность [36]. Для выявления пространственной неоднородности фотосинтетической активности можно использовать визуализацию хлорофилльной флуоресценции [37]. Гиперспектральная спектроскопия отражения растений стала высоко ценимым методом для оценки биологически активных веществ и воды в тканях [33–35,38].

Высокопроизводительная фенотипирующая платформа PlantScreen™, установленная в Лаборатории физиологии продуктивности и экологической физиологии растений Исследовательского центра AgroBioTech при Словацком аграрном университете в Нитре, позволяет использовать датчики RGB, хлорофилльной флуоресценции a и гиперспектральной отражательной спектроскопии для количественного описания структурных и функциональных особенностей фенотипа растений, выращенных в контролируемых условиях окружающей среды. Целью этого пилотного исследования, основанного на данной платформе, было продемонстрировать полезность фенотипирующей установки для описания индуцированных засухой фенотипических изменений у растений томата, а также количественно оценить изменчивость полученных данных в течение всего эксперимента и определить величину фенотипической пластичности путём сравнения изменений в значениях в общей сложности 25 структурных, функциональных и хемометрических признаков.

Семена томата (Solanum lycopersicum L.; сорт Gruzanski zlatni) были посеяны в пластиковые кассеты для рассады (6×4 ячейки; заполнены торфяным субстратом TS2 (Klasmann-Deilmann, Гесте, Германия)). Прорастание растений происходило при интенсивности света 250 μмоль м−2 с−1250μмольм−2с−1 и фотопериоде 14 ч/10 ч14ч/10ч (день/ночь), температуре 25∘C/17∘C25∘C/17∘C (день/ночь) и влажности воздуха 60%60%. После появления всходов растения были пересажены в пластиковые горшки объёмом 5 л, заполненные субстратом TS2, и 40 горшков были зарегистрированы в конвейерной фенотипирующей платформе PlantScreen™ (PSI, Драсов, Чешская Республика). Платформа фенотипирования состоит из культивационного пространства и блоков, содержащих оптические датчики (два RGB, один для хлорофилльной флуоресценции a и два гиперспектральных спектрометра); конфигурация датчиков и культивационная зона с растениями томата показаны на Рисунке 1.

Экспериментальные лотки (хорошо увлажнённые – WW и подверженные водному стрессу – WS соответственно) находились в культивационной зоне платформы в полностью рандомизированном дизайне. Для фенотипирования мы использовали девять растений в группе WW и 15 растений в группе WS. Растения выращивались в течение 48 дней в полностью регулируемых условиях окружающей среды, таких как интенсивность света 1,000 μмоль м−2 с−11,000μмольм−2с−1 (холодный белый свет, тёмно-красный свет и дальний красный свет в пропорции 80, 10 и 10%10% от общей интенсивности света соответственно, измерено спектрофотометром SpectraPen mini, PSI, Драсов, Чешская Республика), фотопериод 14 ч/10 ч14ч/10ч (день/ночь), температура воздуха 25∘C/17∘C25∘C/17∘C (день/ночь), влажность воздуха 40–53%40–53% и концентрация атмосферного CO2CO2​ (350–400 ppm). Записанные параметры условий окружающей среды во время культивирования растений показаны на Рисунке 2. Полив контролировался гравиметрически (±2.0 г)(±2.0г) с использованием весовой и поливочной станции фенотипирующей платформы PlantScreen™ до 70%70% от полной влагоёмкости почвы (SWC; контрольный вес 1,490 г1,490г). Растения, поливаемые по этому протоколу, обозначались как WW. После периода акклиматизации (9 дней после появления всходов, DAE) к условиям окружающей среды и фазы развития третьего полностью развитого листа, цикл обезвоживания случайно выбранных горшков с растениями томата (WS) был инициирован путём прекращения полива до уровня 15%15% SWC. SWC рассчитывалась по уравнению [39]:

где WW – влажный вес субстрата, DW – сухой вес субстрата после высушивания в печи при 105∘C105∘C до постоянного веса. Влажность почвы WW определялась через 10 часов после полного полива субстрата в горшках (100% полевой влагоёмкости) [39].

Сбор изображений программировался с использованием программного обеспечения PlantScreen™ Scheduler (PSI, Драсов, Чешская Республика). Для RGB-визуализации растения фотографировались каждый второй день с использованием обоих RGB-сенсоров в верхней и боковой конфигурации. Технические характеристики используемых датчиков описаны в Таблице 1. Кратко: цветные изображения (5 МП) регистрировались с верхнего ракурса (верхушка растения) и сканировались сбоку под двумя углами (0 и 90 градусов соответственно). Записанные изображения (разрешение 2,560×1,920 Пкс2,560×1,920Пкс) сохранялись в базе данных и обрабатывались с использованием PlantScreen™ Data Analyzer (PSI, Драсов, Чешская Республика).

Метод количественной оценки хлорофилльной флуоресценции a стал важным инструментом, позволяющим оценивать эффективность первичных фотосинтетических реакций в различных условиях выращивания. Таким образом, фотосинтетическая продуктивность растений анализировалась (в среднем каждый четвёртый день) с помощью визуализации хлорофилльной флуоресценции a (CF) с использованием флуориметра FluorCam FC-800MF (технические характеристики показаны в Таблице 1), работающего в импульсном амплитудном режиме (PSI, Драсов, Чешская Республика). Растения загружались в блок CF в ночное время (начиная с 10:00 вечера) в состоянии темновой адаптации фотосистемы II. Для расчёта фотосинтетической продуктивности использовался протокол анализа тушения с интенсивностью актиничного света 600 μмоль м−2 с−1600μмольм−2с−1 холодного белого света.

Для гиперспектрального анализа отражения использовались VNIR (видимая и ближняя инфракрасная область) и SWIR (коротковолновая инфракрасная область) спектрометры (HC) в верхней конфигурации. Технические характеристики для обоих датчиков показаны в Таблице 1. Сначала перед HC-визуализацией выполнялись калибровочные изображения в темноте и при свете (пластина Spectralon). Оба HC-спектрометра (VNIR и SWIR) создают двумерный пространственный массив векторов, представляющих спектр в каждом пикселе изображения. Результирующие 3D-кубы данных изображения содержат два пространственных измерения (оси xx и yy) и одно спектральное измерение (ось zz). Растения загружались в блок HC и освещались одной галогенной лампой (600 Вт, цветовая температура 2600 К). Датчики VNIR и SWIR выполняют съёмку в соответствии с работой сканера.

Для RGB программное обеспечение PlantScreen™ Data Analyzer (PSI, Драсов, Чешская Республика) выполняло три этапа извлечения изображений растений и последующего расчёта параметров роста и морфологии растений. На первом этапе предварительной обработки RGB-изображений автоматически выполнялась коррекция бочкообразных искажений, затем вычитание фона для удаления нерастительных пикселей, подготовка маски растения путём бинаризации изображения и, наконец, RGB-реконструкция изображения в естественных и искусственных цветах. Второй этап обработки данных включал расчёт площади растения и морфологических параметров. Предварительная обработка сырых CF-изображений выполнялась автоматически, включая применение маски растения, вычитание фона и, наконец, попиксельный расчёт CF-параметров. Полученные гиперспектральные данные от обоих датчиков VNIR и SWIR обрабатывались с использованием попиксельного анализа, включающего радиометрическую калибровку и калибровку тёмного шума, вычитание фона и автоматическое вычисление вегетационных индексов. Маска растения при предварительной обработке HC-изображений для каждого изображения строилась из VNIR-куба данных с использованием математической формулы:

Пиксель растения =1.2×[2.5×(R740−R672)−1.3×(R740−R556)]=1.2×[2.5×(R740−R672)−1.3×(R740−R556)]

где R740,R672R740,R672 и R556R556 – значения интенсивности отражения при 740, 672 и 556 нм. Расчёты и краткие описания отдельных рассчитываемых параметров (геометрических, структурных и хемометрических) показаны в Таблице 2. Скорость эвапотранспирации (ET; г H2O дм−2 день−1H2​Oдм−2день−1) рассчитывалась для каждого растения и каждого дня в соответствии с уравнением [40]:

где WA – вес горшка перед поливом в день titi​, WB – вес горшка после дня ti−1ti−1​, AA – надземная площадь растения в titi​, а titi​ – рассматриваемый день, ti−1ti−1​ – предыдущий день.

Данные структурных и функциональных признаков растений, извлечённые из изображений, были проанализированы с использованием программного обеспечения Statistica версия 10 (StatSoft Inc., Талса, ОК, США), пакетов statgenHTP и Outlier Detection Methods (оба из проекта EPPN2020) в среде R-Studio (Posit, PBC, Бостон, США). На первом этапе результаты были проанализированы с помощью теста Граббса, который идентифицирует выбросы между отдельными биологическими повторностями в каждом генотипе и обработке в соответствии с Поуделом и др. [41]. Порог для выбросов и экстремальных значений был установлен как 2-С.К.О. с использованием пакета statgenHTP и методов обнаружения выбросов. Впоследствии для оценки однородности данных и распределения нормальности использовались статистические тесты Левена и Кокрейна с использованием программного обеспечения Statistica. Статистически значимые различия были подвергнуты дисперсионному анализу (ANOVA) при уровне значимости 0.05, а затем пост-хок тесту Тьюки и обозначены как p<0.05∗p<0.05∗, 0.01∗∗0.01∗∗ и 0.001∗∗∗0.001∗∗∗.

Корреляционные взаимосвязи между отдельными признаками оценивались с помощью коэффициента корреляции Пирсона (rp)(rp​). Степень изменчивости признака оценивалась как коэффициент вариации (C.V.; безразмерная единица) по уравнению:

где σσ – стандартное отклонение, μμ – среднее значение.

Величина фенотипической пластичности отдельного признака (PhP) рассчитывалась по уравнению [42]:

где xiWWxiWW​ – среднее значение отдельного признака у WW-растений, а xiWSxiWS​ – среднее значение отдельного признака у WS-растений.

Реализация генетической информации в онтогенетической программе растения и экспрессия фенотипа осуществляются в прямой связи и взаимодействии с окружающей средой. Долгосрочной целью биологов и физиологов растений является изучение и интерпретация структурной и функциональной динамики растительных организмов с использованием неинвазивного подхода визуализации. Цифровое фенотипирование становится популярным инструментом для количественного описания структурных и функциональных признаков растений, особенно связанных с продукцией биомассы и устойчивостью к стрессу. Важной частью количественного описания фенотипа является знание микроклиматических условий среды, в которой происходит рост и развитие растений.

На стадии третьего полностью развитого листа томата (9 DAE) был начат цикл обезвоживания путём прекращения полива почвенного субстрата (Рисунок 3а). У хорошо увлажнённых (WW) растений уровень SWC (содержание воды в почве) поддерживался на уровне 70%70%. У растений, подверженных водному стрессу (WS), SWC непрерывно снижалась, и уровень 15%15% SWC был достигнут через 17 дней постепенного обезвоживания субстрата, что соответствует средней скорости потери воды 3.2%3.2%. В литературе хорошо задокументировано, что медленное и постепенное обезвоживание субстрата позволяет растениям развивать защитные реакции против засухи и повышать степень засухоустойчивости [11,42].

Устойчивость к засухе была идентифицирована как «сложный признак» [43], и наиболее важные признаки устойчивости обеспечивают поддержание гидратации и тургора тканей. У растений тургорное давление играет важную роль в критических процессах, таких как рост, развитие, механическая поддержка, сигнализация, движение органов, цветение и стрессовые реакции растений [44]. В процессе эволюции растения под давлением отбора развили эволюционные стратегии для преодоления засухи через фенотипическую пластичность [45]. Наблюдаемое стресс-индуцированное более высокое значение фенотипической пластичности (PhP) приводит к более значительным различиям в экспрессии фенотипа между WW и WS растениями. В этом исследовании было количественно оценено в общей сложности 25 признаков растений, разделённых на три класса: структурные, функциональные и хемометрические (Таблица 3). Было установлено, что скорость роста площади хорошо увлажнённых растений имеет типичный сигмоидальный ход (Рисунок 3б), и надземная площадь растений достигла уровня 22.96 дм222.96дм2. Как и ожидалось, засуха вызывает статистически значимое снижение роста, с визуально наблюдаемым фенотипическим проявлением уже на 25 DAE (Рисунок 3в). Засуха значительно и отрицательно повлияла на формирование вертикальной архитектуры растения (Таблица 3). Высота растения (H), компактность (Comptoptop) и стройность листьев (SOL) считаются наиболее важными геометрическими параметрами вертикальной структуры растений, которые чувствительно отражают нарушения роста растений и эволюцию площади листьев в стрессовых ситуациях. Фенотипическая экспрессия этих признаков относительно однородна между отдельными растениями, растущими в данной среде (WW и WS), что документируется низким значением изменчивости (C.V. от 0.04 до 0.15 безразмерных единиц) и высоким значением частного η2η2 (Таблица 3). В этом эксперименте было замечено, что фенотипическое проявление признаков, описывающих геометрию и вертикальную структуру взрослых растений томата, является более сложным, чем у видов растений на ювенильных стадиях онтогенеза [46] и/или формирующих небольшое количество листьев [47] или, наконец, таких растений, которые формируют розетку листьев [36].

Используя прецизионную весовую и поливочную станцию системы фенотипирования PlantScreen™, скорость эвапотранспирации (ET) рассчитывалась в течение онтогенеза растений томата (Рисунок 4). ET исследовалась более подробно в эксперименте с регулярными двухдневными интервалами, чтобы понять причинно-следственную значимость физиологических и морфологических реакций растений томата на засуху. В начале онтогенеза мы определили скорость испарения воды с поверхности растения и почвы на уровне 147±11 г H2O147±11гH2​O на дм2дм2 площади листьев в день. В течение роста листовой поверхности растений мы наблюдали значительное снижение ET (почти на 35%35%) даже у WW, что можно отнести к прогрессивному формированию кутикулы растений [48], оптимизации поведения устьиц [49] или снижению испарения воды с поверхности почвы из-за увеличения размера растений (Рисунок 3б и в). В то время, когда уровень SWC у WS растений достиг значения 15%15%, ET была на уровне 20±5 г дм−2 день−120±5гдм−2день−1. Аналогичная онтогенетическая изменчивость ET наблюдалась у растений пшеницы в предыдущем исследовании [32], но, в отличие от него, наше одновременное фенотипирование растений вместе с цифровой оценкой площади листьев позволяет рассчитывать потери воды на единицу площади листьев. Несмотря на то, что RGB-фенотипирование на основе изображений интенсивно используется для описания структурных особенностей фенотипов многих видов растений, насколько нам известно, существует лишь несколько комплексных исследований, которые всесторонне описывали бы анатомические признаки визуального проявления морфологии растений. Помимо содержания воды в почве, важную роль в формировании анатомии тканей и морфологии растений играет дефицит давления паров (VPD). Например, Амитрано и др. [50] используют комбинацию фенотипирования на основе изображений с углублённым анатомическим анализом при изучении реакций растений салата на засуху и VPD.

Метод хлорофилльной флуоресценции a был и остаётся успешно используемым в фундаментальных фотосинтетических исследованиях, но также нашёл применение в скрининге в селекции [10,51]. Формирование функциональных признаков фотосинтетической продуктивности растений в течение онтогенеза у WW и WS показано на Рисунке 5. Минимальная (Fo) и максимальная (Fm) интенсивность хлорофилльной флуоресценции a в течение онтогенеза растений незначительно увеличивается у WW. Обычно наблюдаемой реакцией на засуху является снижение как Fo, так и Fm соответственно. В нашем эксперименте было замечено, что WS индуцировал статистически значимое (p<0.001)(p<0.001) снижение Fo и Fm с 16-го дня водного стресса, и Fo реагирует быстрее и более чувствительно на стресс (Рисунок 5а и б). Эта акклимационная реакция приписывается индукции фотозащитных механизмов и/или повреждению фотосистемы PSII [52].

Максимальная фотохимическая эффективность PSII (Fv/Fm) является хорошим показателем реакций растений на многие стрессовые ситуации [51]. Однако Fv/Fm относительно стабильна у многих видов растений, включая томаты, в условиях умеренной засухи, снижаясь только при сильной засухе [53,54]. Максимальная фотохимическая эффективность PSII (Fv/Fm) незначительно увеличивалась выше значения 0.830 в первой фазе онтогенеза растений (Рисунок 5в). У WS растений снижение значения Fv/Fm наблюдалось только с двадцать первого дня обезвоживания, когда растения уже выращивались в течение 10 дней при 15%15% SWC. В конце цикла обезвоживания Fv/Fm значительно снизилась (p<0.001)(p<0.001) до 0.780±0.0180.780±0.018 (Таблица 3).

Поскольку метод полноэкранной визуализации хлорофилльной флуоресценции a документирует средний уровень Fv/Fm от всего растения [24], мы подтвердили неоднородность между отдельными листьями. Рисунок 5g также документирует этот факт. Гораздо более чувствительным параметром, описывающим первичные реакции фотосинтеза при стрессе, является фактическая фотохимическая эффективность PSII (ΔF/Fm)(ΔF/Fm). У WW ΔF/FmΔF/Fm увеличивалась в течение онтогенеза растений (Рисунок 5d). Индуцированное засухой снижение ΔF/FmΔF/Fm наблюдалось у WS растений уже на 5-й день обезвоживания (p<0.001)(p<0.001). Параметр ΔF/FmΔF/Fm отражает как максимальную фотохимическую эффективность PSII при актиничном свете, так и эффективность тепловой диссипации энергии возбуждения не-фотохимическими процессами (NPQ). Наивысший уровень не-фотохимического тушения хлорофилльной флуоресценции (NPQ) наблюдался у ювенильных растений томата (1.40±0.10)(1.40±0.10). В течение онтогенеза NPQ снижался в большей степени у растений, подверженных водному стрессу [0.924±0.101[0.924±0.101 у WW против 0.590±0.1290.590±0.129 у WS; p<0.001p<0.001 (Таблица 3). Значительное индуцированное обезвоживанием снижение уровня NPQ (p<0.001)(p<0.001) у всего растения по сравнению с WW появилось на одиннадцатый день засухи (Рисунок 5e). Удивительным открытием является то, что формирование ассимиляционной поверхности растений сопровождалось снижением значения NPQ в течение онтогенеза. Это хорошо иллюстрирует, что визуализация NPQ в течение онтогенеза позволяет эффективно визуализировать физиологические процессы и активности, включая связанные с ними неоднородности. Более высокая активность тепловой диссипации энергии возбуждения наблюдалась у онтогенетически более молодых (верхних) листьев, чем у онтогенетически более старых (нижних) листьев. Таким образом, наши результаты эффективно вносят вклад в знания о зависящих от вида растений онтогенетических изменениях NPQ, которые хорошо документированы в литературе [55,56].

Параметр Rfd (относительное снижение флуоресценции) прямо коррелирует с чистой скоростью ассимиляции CO2CO2​ листьев многих растений, подверженных различным условиям окружающей среды [57]. Как и параметр NPQ, самый высокий уровень Rfd наблюдался у ювенильных растений томата (2.016±0.138)(2.016±0.138). В течение онтогенеза общий уровень Rfd всего растения быстро снижался (до 22 DAE) и поддерживал стабильный уровень как у WW, так и у WS растений. В конечном итоге, водный стресс привёл к значительному снижению (p<0.001)(p<0.001) Rfd, с более высокой активностью у более молодых листьев, чем у старых (Рисунок 5f и g).

Гиперспектральная отражательная спектроскопия является отличным инструментом для количественной оценки изменений содержания биологически значимых веществ в листьях растений в стрессовых ситуациях [12,33,35]. Неразрушающая хемометрия с использованием VNIR- и SWIR-гиперспектральных датчиков, установленных на платформе PlantScreen™, позволила нам оценить индуцированную засухой кинетику изменений содержания воды (Water-1), ассимиляционных пигментов (NDVI, MCARI-1), хлорофилла a (CHLa), каротиноидов (CRI-1) и антоцианов (ARI-1) в листьях томата (Таблица 3 и Рисунок 6). По мере усиления засухи параметр Water-1 увеличивается и сильно (отрицательно; rp=−0.84rp​=−0.84; p<0.001p<0.001) коррелирует с SWC (Рисунки 6а и 7б), и низкая изменчивость (C.V.) наблюдалась в пределах каждой обработки (Рисунок 7а). Эти результаты показывают, что использование SWIR-датчика для оценки содержания воды является более точным, чем использование VNIR-индексов [35]. Индексы, количественно определяющие содержание ассимиляционных пигментов (NDVI и MCARI-1), показали самую низкую фенотипическую пластичность среди хемометрических параметров. С другой стороны, стресс засухи индуцировал почти трёхкратное увеличение концентрации антоцианов (ARI-1) в растениях томата.

Значительным преимуществом использования современных автоматических фенотипирующих платформ, оценивающих многие морфологические и физиологические параметры, является количественная оценка фенотипической пластичности (PhP) признака (Таблица 3). PhP характеризуется способностью организма претерпевать обратимые морфологические, биохимические или физиологические изменения в ответ на условия окружающей среды [45]. В этом исследовании некоторые геометрические признаки показали относительно низкие уровни индуцированной засухой PhP (особенно Isotoptop, Round-2toptop и Compsideside) в диапазоне от –9.57 до –26.03; эти значения всё ещё выше, чем сообщалось в более ранней литературе [46]. Отрицательное значение рассчитанной PhP означает снижение уровня данного признака из-за засухи. В нашем эксперименте было замечено, что в отличие от геометрических признаков, функциональные и хемометрические признаки имеют потенциал для быстрой пластичности в условиях WS. Это в основном касается индуцированных засухой изменений содержания хлорофилла a (CHLa), каротиноидов (CRI-1) и антоцианов (ARI-1, идентифицированные значения PhP от 50 до 300), что обусловлено как силой, так и продолжительностью стресса. Оценка фенотипической пластичности морфологических и физиологических признаков находит применение в селекционных стратегиях для создания нового биологического материала томатов, устойчивых к засухе [11,49,58]. Таким образом, в селекционных программах отбор генотипов на основе признаков с более низкой фенотипической пластичностью может способствовать повышению продуктивности в условиях засухи.

Наконец, чувствительность оценки реакций растений на засуху с помощью цифрового фенотипирования была подтверждена корреляционным анализом (Рисунок 7б), который подтвердил очень тесную зависимость ET, AA и содержания воды в растениях (индекс Water-1) от SWC (rp>0.80;p<0.001)(rp​>0.80;p<0.001). Другие морфологические признаки (Comp, Round, RMS, Ecc и Iso) были менее коррелированы с содержанием воды (rp=0.20–0.40)(rp​=0.20–0.40), за исключением высоты растений (rp=0.63;p<0.001)(rp​=0.63;p<0.001). Функциональные признаки фотосинтетической эффективности характеризуются высокой зависимостью от SWC (rp=0.50–0.73;p<0.001)(rp​=0.50–0.73;p<0.001), за исключением Fv/Fm (rp=0.17)(rp​=0.17).

Современное высокопроизводительное фенотипирование растений (HTTP) — это технология, позволяющая одновременно оценивать большое количество признаков. Как показало представленное тематическое исследование на растениях томата, использование цифровых методов визуализации растений и расчёта структурных и функциональных параметров имеет ряд преимуществ по сравнению с классическими методами описания фенотипа. Цифровая визуализация оптических сигналов от растений является неинвазивной и неразрушающей и позволяет оценивать фенотип растения на протяжении всего онтогенеза. Система цифровой визуализации позволила создать базы данных морфофизиологических признаков, доступные для повторного анализа и обмена информацией. Кроме того, цифровая визуализация позволяет одновременно рассчитывать несколько независимых параметров, что повышает общую прогностическую ценность фенотипа, реализованного в конкретной среде. Исследование документировало статистически значимую сложность морфологических и физиологических реакций растений томата, подверженных водному стрессу. Геометрические признаки растений, особенно Isotoptop, Round-2toptop и Compsideside, показали относительно низкий уровень индуцированной засухой фенотипической пластичности (PhP). С другой стороны, функциональные и хемометрические характеристики (особенно параметры ΔF/FmΔF/Fm, Rfd, Water-1 и ARI-1) показали потенциал для быстрой пластичности в условиях WS. Аналогично, эксперименты на томатах подтвердили надёжность и воспроизводимость неразрушающей количественной HTTP-оценки отдельных морфофизиологических признаков в отдельных повторностях (C.V. до 0.20), особенно в условиях WS. В заключение, количественная оценка изменчивости отдельных признаков у хорошо увлажнённых (WW) и подверженных водному стрессу (WS) растений, а также фенотипическая пластичность признаков и корреляционный анализ указывают на огромный потенциал использования цифрового фенотипирования растений, подверженных стрессовым ситуациям.

Финансирование: Это исследование было поддержано исследовательскими проектами Словацкого агентства по исследованиям и разработкам APVV-SK-SRB-21-0043, APVV-20-0071 и APVV SK-CN-21-0045.

Вклад авторов: Все авторы приняли ответственность за всё содержание этой рукописи и дали согласие на её представление в журнал, проверили все результаты. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи. MK и MZ – методология; MK, MZ, IV – программное обеспечение; MK – валидация; MK, AF и LJ – формальный анализ; MK – исследование; MK и IV – ресурсы; MK, IV и DP – курирование данных; MK – написание исходного черновика; MK, MZ, MB и XY – рецензирование и редактирование; MK – визуализация; MB и DP – руководство; MB, VB и XY – управление проектом; MB, VB и XY – получение финансирования.

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Доступность данных: Обмен данными не применим к этой статье, так как в ходе текущего исследования не было сгенерировано или проанализировано никаких наборов данных.

[1] Tardieu F, Simonneau T, Muller B. The physiological basis of drought tolerance in crop plants: A scenario-dependent probabilistic approach. Annu Rev Plant Biol. 2018;69(1):733-59. doi: 10.1146/annurev-arplant-042817-040218.

[2] Wheeler T, von Braun J. Climate change impacts on global food security. Science. 2013;341(6145):508-13. doi: 10.1126/science.1239402.

[3] Bashir SS, Hussain A, Hussain SJ, Wani OA, Zahid Nabi S, Dar NA, et al. Plant drought stress tolerance: Understanding its physiological, biochemical and molecular mechanisms. Biotechnol & Biotechnol Equip. 2021;35(1):1912-25. doi: 10.1080/13102818.2021.2020161.

[4] Lozano-Elena F, Fabregas N, Colet-Alcudia V, Caño-Delgado AI. Analysis of metabolic dynamics during drought stress in arabidopsis plants. Sci Data. 2022;9(1):90. doi: 10.1038/s41597-022-01161-4.

[5] Cardoso LL, Freire FBS, Dalsso DM. Plant metabolic networks under stress: A multi-species/stress condition meta-analysis. J Soil Sci Plant Nutr. 2023;23(1):4-21. doi: 10.1007/s42729-022-01032-2.

[6] Favreau B, Gaal C, Pereira de Lima I, Droc G, Roques S, Sotillo A, et al. A multi-level approach reveals key physiological and molecular traits in the response of two rice genotypes subjected to water deficit at the reproductive stage. Plant-Environ Interact. 2023;4(5):229-57. doi: 10.1002/pei3.10121.

[7] Koch G, Rolland G, Dauzat M, Bédiée A, Baldazzi V, Bertin N, et al. Leaf production and expansion: A generalized response to drought stresses from cells to whole leaf biomass - A case study in the tomato compound leaf. Plants. 2019;8(10):409. doi: 10.3390/plants8100409.

[8] Li S, Liu J, Liu H, Qiu R, Gao Y, Duan A. Role of hydraulic signal and ABA in decrease of leaf stomatal and mesophyll conductance in soil drought-stressed tomato. Front Plant Sci. 2021;12:653186. doi: 10.3389/fpls.2021.653186.

[9] Chaves MM, Flexas J, Pinheiro C. Photosynthesis under drought and salt stress: Regulation mechanisms from whole plant to cell. Ann Bot. 2009;103(4):551-60. doi: 10.1093/aob/mcn125.

[10] Kalaji HM, Jajoo A, Oskarroum A, Brestic M, Zivcak M, Samborska IA, et al. Chlorophyll a fluorescence as a tool to monitor physiological status of plants under abiotic stress conditions. Acta Physiol Plant. 2016;38(4):102. doi: 10.1007/s11738-016-2113-y.

[11] Liang G, Liu J, Zhang J, Guo J. Effects of drought stress on photosynthetic and physiological parameters of tomato. J Am Soc Hortic Sci. 2020;145(1):12-7. doi: 10.21273/JASHS04725-19.

[12] Yang X, Li Y, Chen H, Huang J, Zhang Y, Qi M, et al. Photosynthetic response mechanism of soil salinity-induced cross-tolerance to subsequent drought stress in tomato plants. Plants. 2020;9(3):363. doi: 10.3390/plants9030363.

[13] Blum A. Osmotic adjustment is a prime drought stress adaptive engine in support of plant production. Plant Cell Environ. 2017;40(1):4-10. doi: 10.1111/pce.12800.

[14] Gupta A, Rico-Medina A, Caño-Delgado AI. The physiology of plant responses to drought. Science. 2020;368(6488):266-9. doi: 10.1126/science.aaz7614.

[15] Sousaraei N, Mashayekhi K, Mousavizadeh SJ, Akbarpour V, Medina J, Aliniaiefard S. Screening of tomato landraces for drought tolerance based on growth and chlorophyll fluorescence analyses. Hortic Env Biotechnol. 2021;62(4):521-35. doi: 10.1007/s13580-020-00328-5.

[16] Conti V, Parrotta L, Romi M, Del Duca S, Cai G. Tomato biodiversity and drought tolerance: A multilevel review. Int J Mol Sci. 2023;24(12):10044. doi: 10.3390/ijms241210044.

[17] Furbank RT, Tester M. Phenomics - Technologies to relieve the phenotyping bottleneck. Trends Plant Sci. 2011;16(12):635-44. doi: 10.1016/j.tplants.2011.09.005.

[18] Rebetzke GJ, Jimenez-Berni J, Fischer RA, Deery DM, Smith DJ. Review: High-throughput phenotyping to enhance the use of crop genetic resources. Plant Sci. 2019;282:40-8. doi: 10.1016/j.plantsci.2018.06.017.

[19] Watt M, Fiorani F, Usadel B, Rascher U, Muller O, Schurr U. Phenotyping: New windows into the plant for breeders. Annu Rev Plant Biol. 2020;71(1):689-712. doi: 10.1146/annurev-arplant-042916-041124.

[20] Yang W, Feng H, Zhang X, Zhang J, Doonan JH, Batchelor WD, et al. Crop phenomics and high-throughput phenotyping: Past decades, current challenges, and future perspectives. Mol Plant. 2020;13(2):187-214. doi: 10.1016/j.molp.2020.01.008.

[21] Fiorani F, Schurr U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu Rev Plant Biol. 2013;64(1):267-91. doi: 10.1146/annurev-arplant-050312-120137.

[22] Poorter H, Hummel GM, Nagel KA, Fiorani F, von Gillhaussen P, Virnich O, et al. Pitfalls and potential of high-throughput plant phenotyping platforms. Front Plant Sci. 2023;14:1233794. doi: 10.3389/fpls.2023.1233794.

[23] Granier C, Aguirrezabal L, Chenu K, Cookson SJ, Dauzat M, Hamard P, et al. PHENOPSIS, an automated platform for reproducible phenotyping of plant responses to soil water deficit in Arabidopsis thaliana permitted the identification of an accession with low sensitivity to soil water deficit. N Phytol. 2006;169(3):623-35. doi: 10.1111/j.1469-8137.2005.01609.x.

[24] Jansen M, Gilmer F, Biskup B, Nagel KA, Rascher U, Fischbach A, et al. Simultaneous phenotyping of leaf growth and chlorophyll fluorescence via GROWSCREEN FLUORO allows detection of stress tolerance in Arabidopsis thaliana and other rosette plants. Funct Plant Biol. 2009;36(11):902-14. doi: 10.1071/FP09095.

[25] Nagel KA, Putz A, Gilmer F, Heinz K, Fischbach A, Pfeifer J, et al. GROWSCREEN-rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct Plant Biol. 2012;39(11):891-904. doi: 10.1071/FP12023.

[26] Chen D, Neumann K, Friedel S, Kilian B, Chen M, Altmann T, et al. Dissecting the phenotypic components of crop plant growth and drought responses based on high-throughput image analysis. Plant Cell. 2014;26(12):4636-55. doi: 10.1105/tpc.114.129601.

[27] Klukas C, Chen D, Pape J-M. Integrated analysis platform: An open-source information system for high-throughput plant phenotyping. Plant Physiol. 2014;165(2):506-18. doi: 10.1104/pp.113.233932.

[28] Al-Tamimi N, Brien C, Oakey H, Berger B, Saade S, Ho YS, et al. Salinity tolerance loci revealed in rice using high-throughput noninvasive phenotyping. Nat Commun. 2016;7(1):13342. doi: 10.1038/ncomms13342.

[29] Asaari MSM, Mertens S, Dhondt S, Inzé D, Wuyts N, Scheunders P. Analysis of hyperspectral images for detection of drought stress and recovery in maize plants in a high-throughput phenotyping platform. Computers Electron Agric. 2019;162:749-58. doi: 10.1016/j.compag.2019.05.018.

[30] Li D, Quan C, Song Z, Li X, Yu G, Li C, et al. High-throughput plant phenotyping platform (HTP) as a novel tool for estimating agronomic traits from the lab to the field. Front Bioeng Biotechnol. 2021;13(8):623705. doi: 10.3389/fbioe.2020.623705.

[31] Ngo HTT, Cavagnaro TR, Jewell N, Brien CJ, Berger B, Watts-Williams SJ. High-throughput shoot phenotyping reveals temporal growth responses to nitrogen and inorganic and organic phosphorus sources in tomato. AoB Plants. 2023;15(2):plad011. doi: 10.1093/aobpla/plad011.

[32] Correia PMP, Cairo Westergaard J, Bernardes da Silva A, Roitsch T, Carmo-Silva E, Marques da Silva J. High-throughput phenotyping of physiological traits for wheat resilience to high temperature and drought stress. J Exp Bot. 2022;73(15):5235-51. doi: 10.1093/jxb/erac160.

[33] Corti M, Marino Gallina P, Cavalli D, Cabassi G. Hyperspectral imaging of spinach canopy under combined water and nitrogen stress to estimate biomass, water, and nitrogen content. Biosyst Eng. 2017;158:38-50. doi: 10.1016/j.biosystemseng.2017.03.006.

[34] Sytar O, Brestic M, Zivcak M, Olsovska K, Kovar M, Shao H, et al. Applying hyperspectral imaging to explore natural plant diversity towards improving salt stress tolerance. Sci Total Environ. 2017;578:90-9. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.08.014.

[35] Kovar M, Brestic M, Sytar O, Barek V, Hauptvogel P, Zivcak M. Evaluation of hyperspectral reflectance parameters to assess the leaf water content in soybean. Water. 2019;11(3):443. doi: 10.3390/w11030443.

[36] de Vylder J, Vandenbussche F, Hu Y, Philips W, Van Der Straeten D. Rosette tracker: An open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects. Plant Physiol. 2012;160(3):1149-59. doi: 10.1104/pp.112.202762.

[37] Tschiersch H, Junker A, Meyer RC, Altmann T. Establishment of integrated protocols for automated high throughput kinetic chlorophyll fluorescence analyses. Plant Methods. 2017;13(1):54. doi: 10.1186/s13007-017-0204-4.

[38] Jiang L, Sun L, Ye M, Wang J, Wang Y, Bogard M, et al. Functional mapping of N deficiency-induced response in wheat yield-component traits by implementing high-throughput phenotyping. Plant J. 2019;97(6):1105-19. doi: 10.1111/tpj.14186.

[39] Berger B, de Regt B, Tester M. High-throughput phenotyping of plant shoots. In: Normanly J, editor. High-throughput phenotyping in plants: Methods and protocols. Totowa, NJ: Methods in Molecular Biology; Humana Press; 2012. p. 9-20. doi: 10.1007/978-1-61779-995-2_2.

[40] Morota G, Jarquin D, Campbell MT, Iwata H. Statistical methods for the quantitative genetic analysis of high-throughput phenotyping data. Methods Mol Biol. 2022;2539:269-96. doi: 10.1007/978-1-0716-2537-8_21.

[41] Poudel S, Adhikari B, Dhillon J, Reddy KR, Stetina SR, Bheemanahalli R. Quantifying the physiological, yield, and quality plasticity of southern USA soybeans under heat stress. Plant Stress. 2023;9:100195. doi: 10.1016/j.stress.2023.100195.

[42] Fang Y, Xiong L. General mechanisms of drought response and their application in drought resistance improvement in plants. Cell Mol Life Sci. 2015;72(4):673-89. doi: 10.1007/s00018-014-1767-0.

[43] Blum A. Drought resistance - Is it a complex trait? Funct Plant Biol. 2011;38(10):753-7. doi: 10.1071/FP11101.

[44] Fricke W. Turgor pressure. In: Encyclopedia of life sciences. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd; 2017. p. 1-6. doi: 10.1002/9780470015902.a0001687.pub2.

[45] Gratani L. Plant phenotypic plasticity in response to environmental factors. Adv Bot. 2014;2014:e208747. doi: 10.1155/2014/208747.

[46] Janni M, Coppede N, Bettelli M, Briglia N, Petrozza A, Summerer S, et al. In vivo phenotyping for the early detection of drought stress in tomato. Plant Phenomics. 2019;2019:6168209. doi: 10.34133/2019/6168209.

[47] Junker A, Muraya MM, Weigelt-Fischer K, Arana-Ceballos F, Klukas C, Melchinger AE, et al. Optimizing experimental procedures for quantitative evaluation of crop plant performance in high throughput phenotyping systems. Front Plant Sci. 2015;5:770. doi: 10.3389/fpls.2014.00770.

[48] Bi H, Kovalchuk N, Langridge P, Tricker PJ, Lopato S, Borisjuk N. The impact of drought on wheat leaf cuticle properties. BMC Plant Biol. 2017;17(1):85. doi: 10.1186/s12870-017-1033-3.

[49] Zhou R, Kong L, Wu Z, Rosenqvist E, Wang Y, Zhao L, et al. Physiological response of tomatoes at drought, heat and their combination followed by recovery. Physiol Plant. 2019;165(2):144-54. doi: 10.1111/ppl.12764.

[50] Amitrano C, Junker A, D'Agostino N, De Pascale S, De Micco V. Integration of high-throughput phenotyping with anatomical traits of leaves to help understanding lettuce acclimation to a changing environment. Planta. 2022;256:68. doi: 10.1007/s00425-022-03984-2.

[51] Baker NR. Chlorophyll fluorescence: A probe of photosynthesis in vivo. Annu Rev Plant Biol. 2008;59(1):89-113. doi: 10.1146/annurev.arplant.59.032607.092759.

[52] Banks JM. Chlorophyll fluorescence as a tool to identify drought stress in acer genotypes. Environ Exp Botany. 2018;155:118-27. doi: 10.1016/j.envexpbot.2018.06.022.

[53] Zivcak M, Brestic M, Olsovska K, Slamka P. Performance index as a sensitive indicator of water stress in Triticum aestivum L. Plant Soil Environ. 2008;54(4):133-9. doi: 10.17221/392-PSE.

[54] Moles TM, Mariotti L, De Pedro LF, Guglielminetti L, Picciarelli P, Scartazza A. Drought induced changes of leaf-to-root relationships in two tomato genotypes. Plant Physiol Biochem. 2018;128:24-31. doi: 10.1016/j.plaphy.2018.05.008.

[55] Carvalho FEL, Ware MA, Ruban AV. Quantifying the dynamics of light tolerance in arabidopsis plants during ontogenesis. Plant Cell Environ. 2015;38(12):2603-17. doi: 10.1111/pce.12574.

[56] Ghorbanzadeh P, Aliniaiefard S, Esmaeili M, Mashal M, Azadegan B, Seif M. Dependency of growth, water use efficiency, chlorophyll fluorescence, and stomatal characteristics of lettuce plants to light intensity. J Plant Growth Regul. 2021;40(5):2191-207. doi: 10.1007/s00344-020-10269-z.

[57] Lichtenthaler HK, Buschmann C, Knapp M. How to correctly determine the different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio RFd of leaves with the PAM fluorometer. Photosynthetica. 2005;43(3):379-93. doi: 10.1007/s11099-005-0062-6.

[58] Conti V, Romi M, Parri S, Aloisi I, Marino G, Cai G, et al. Morpho-physiological classification of Italian tomato cultivars (Solanum Lycopersicum L.) according to drought tolerance during vegetative and reproductive growth. Plants. 2021;10(9):1826. doi: 10.3390/plants10091826.